鈣調蛋白激酶Ⅱ抑制劑KN62對肝星狀細胞增殖、凋亡的影響及機制

王路廣 戴琳玉 閆宇 肖永紅

1華北理工大學公共衛生學院（河北唐山063210）；2 天津醫科大學第二醫院（天津300211）

多種因素引發肝臟慢性損傷后產生的代償性修復反應稱為肝纖維化[1]。肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化在肝纖維化的進展中起重要作用，導致膠原生成、沉積形成肝纖維化，進一步發展到肝硬化。因此，延遲活化的HSC的增殖和誘導其凋亡是阻斷、抑制或逆轉肝纖維化的治療策略[2]。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是刺激HSC 活化、增殖的促纖維化細胞因子之一，可以促進鈣調蛋白激酶Ⅱ（calmodulin kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ）mRNA 以及磷酸化的CaMKII表達，增加細胞外基質及膠原蛋白合成[3-4]。內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）為各類器官纖維化發病機制中的信號串聯轉導通路，其介導的凋亡途徑是近年來發現的新的凋亡途徑[5]。CaMKⅡ是一種功能多樣的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過調節從內質網到細胞質的細胞內Ca2+動員，充當ERS和相關細胞凋亡的關鍵介質，在體內廣泛參與細胞生理功能調節，包括細胞鈣穩態、細胞形態、凋亡等[6]。近年來研究發現干預CaMKⅡ的激活有效改善了心肌、肺、腎臟以及口腔黏膜等纖維化的發生發展[7-10]，對肝纖維化的進展亦有阻逆作用[11]，然而具體作用機制復雜，是否引發了ERS 凋亡途徑從而影響HSC的增殖和激活，目前尚不清楚。故本研究應用CaMKⅡ抑制劑KN62 作用TGF-β1刺激的HSC，探討其對細胞增殖、凋亡的影響及可能的機制，以尋找防治肝纖維化新的途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑LX2 人肝星形細胞（LX2-HSC）（上海美軒生物科技有限公司）；KN62 粉末購自美國Apexbio公司，胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶均購自美國BI公司，DMEM高糖培養基、TGF-β1（批號：PHG 9204）購自美國Gibco公司，青霉素、鏈霉素混合液（雙抗）購自美國Sigma公司，細胞增殖檢測試劑盒（CCK-8）、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒均購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，一步TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自大連美侖生物科技有限公司，蛋白酶抑制劑、RIPA 裂解液購自武漢貝博生物公司，BCA蛋白定量試劑盒購自杭州聯科生物公司，兔抗CaMKII多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗Bax 單克隆抗體、兔抗caspase-12多克隆抗體購自美國Arigo公司，兔抗β-actin多克隆抗體購自美國ABclonal公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記抗兔IgG（H+L）購自美國KPL公司。

1.2 細胞培養將存放于液氮中的LX2-HSC細胞復蘇、傳代，于含有各100 U/mL 青霉素、鏈霉素、10%血清的DMEM 高糖培養基的培養液中培養，置于37℃、5% CO2的細胞孵育箱中培養，隔天換液。當細胞密度達到80%～90%時，胰蛋白酶進行傳代并進行常規培養。

1.3 CCK-8 法檢測細胞的增殖選取處于對數生長期的LX2細胞，0.25%胰酶消化離心，以1×103個/孔接種于96孔板，每孔100 μL，細胞孵育箱中培養24 h，更換無血清培養液過夜，分別加入1、5、10、20 μmol/L KN62，各培養1、3、6、12、24 h后，每孔加入10 μL CCK8 溶液培養3 h，于450 nm 下測定各孔吸光值（OD），重復測定3次，計算各組細胞的相對增殖率（relative growth rate，RGR）。RGR=藥物組OD值/對照組OD值×100%

根據實驗結果，后續實驗分為5 組：空白對照組、TGF-β1組、低、中、高濃度KN62+ TGF-β1組?？瞻讓φ战M加入無血清培養基培養24 h，TGF-β1組加入5 ng/mL TGF-β1作用24 h，低、中、高濃度KN62+TGF-β1組分別用1、5、10 μmol/L KN62 作用6 h，再加入5 ng/mL TGF-β1作用細胞24 h，用上述方法檢測不同處理組細胞增殖情況。

1.4 TUNEL 法檢測細胞凋亡將處于對數生長期的LX2細胞以2.5×105/mL 接種于24孔板中，每孔500 μL，進行不同分組方法處理后，用4%多聚甲醛常溫下固定細胞30 min，用PBS 洗滌1次。在樣本上滴加適量Proteinase K（20 μg/mL），室溫孵育5 min。嚴格按照TUNEL 凋亡試劑盒的具體要求操作，于熒光顯微鏡下觀察、拍照，計算出各組凋亡陽性的細胞數及凋亡細胞率，紅色為已凋亡細胞之細胞核，藍色則為尚未凋亡細胞之細胞核，然后計算出各組細胞的凋亡率。凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.5 Western Blot 法檢測蛋白的表達情況細胞經分組及處理后，預冷的PBS清洗3遍，加入細胞裂解液（蛋白酶抑制劑：RIPA 裂解液=1∶250）200 μL，冰上裂解細胞30 min后提取細胞總蛋白。采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，100℃干式恒溫器中加熱10 min，置于-20℃備用。配制12% SDSPAGE 凝膠，蛋白上樣量統一為20 μg，進行電泳。濕轉1 h，封閉完成后，一抗稀釋液4℃震蕩過夜，TBST 溶液清洗3次，二抗HRP 標記抗兔IgG（H+L）稀釋液37℃孵育1 h，TBST 溶液清洗3次。ECL 發光劑A、B 等量混合，每個條帶100 μL檢測條帶，凝膠成像儀觀察蛋白的表達。采用Image J軟件測定條帶灰度值，計算各組目的蛋白的相對表達量。

1.6 統計學方法采用SPSS 21.0軟件進行數據統計學分析，實驗數據以表示，多組均數比較用F分析，兩兩均數比較用LST檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度KN62 作用不同時間LX2-HSC細胞增殖情況作用1 h，各處理組細胞OD值差異無統計學意義（F=1.778，P＞0.05），作用3 h，不同濃度組OD值差異仍無統計學意義（P＞0.05），作用6 h后各時間點，不同濃度KN62 處理組OD值差異均有統計學意義（P＜0.001），但10 μmol/L 與20 μmol/L KN62 組OD值比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；10 μmol/L KN62 作用12、24 h后，細胞OD值與6 h比較，差異均無統計學意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 不同濃度KN62 作用不同時間對人HSC 增殖的影響Fig.1 Effect of different concentration KN62 on the proliferation of human hepatic stellate cells at different time

2.2 不同處理組LX2-HSC細胞增殖情況不同處理組LX2 增殖率比較差異有統計學意義（F=80.070，P＜0.001）。與空白對照組相比，TGF-β1組LX2增殖率明顯升高（P＜0.001），不同濃度KN62 處理組與TGF-β1組比較，增殖率降低，且隨著KN62濃度增加，增殖率下降（P＜0.05，表1）。

表1 不同處理組人HSC細胞增殖情況Tab.1 The proliferation of hepatic stellate cell in different treatment groups±s

表1 不同處理組人HSC細胞增殖情況Tab.1 The proliferation of hepatic stellate cell in different treatment groups±s

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05；與TGF-β1組比較，#P ＜0.05；與KN62 低濃度+TGF-β1組比較，□P ＜0.05；與KN62 中濃度+TGF-β1組比較，△P ＜0.05

組別空白對照組TGF-β1組KN62 低濃度+TGF-β1組KN62 中濃度+TGF-β1組KN62 高濃度+TGF-β1組例數3 3 3 3 3 OD 值0.822±0.053 0.972±0.047* 0.674±0.063*# 0.552±0.038*#□ 0.409±0.035*#□△ RGR（%）100.0 119.0 82.3 67.4 50.1 F 值80.070 P 值＜0.001

2.3 不同處理組LX2-HSC 凋亡情況不同處理組LX2 凋亡率比較差異有統計學意義（F=73.199，P＜0.001）。TGF-β1組與空白對照組比較，LX2細胞凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）；低、中、高濃度KN62 處理組細胞凋亡率較TGF-β1組顯著升高（P＜0.05），隨KN62 濃度的增加，LX2的細胞凋亡率增高（P＜0.001，圖2、表2）。

表2 不同處理組人HSC 凋亡情況Tab.2 The apoptosis changes of human hepatic stellate cell in different treatment groups ±s

表2 不同處理組人HSC 凋亡情況Tab.2 The apoptosis changes of human hepatic stellate cell in different treatment groups ±s

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05；與TGF-β1組比較，#P ＜0.05；與KN62 低濃度+TGF-β1組比，□P ＜0.05；與KN62 中濃度+TGF-β1組比較，△P ＜0.05

組別空白對照組TGF-β1組KN62 低濃度+TGF-β1組KN62 中濃度+TGF-β1組KN62 高濃度+TGF-β1組例數3 3 3 3 3凋亡率（%）13.6±2.6 13.5±2.3 30.8±6.1*# 54.5±4.5*#□ 75.7±5.6*#□△ F 值73.199 P 值＜0.001

2.4 不同處理組LX2-HSC內CaMKⅡ蛋白的表達不同處理組細胞中CaMKⅡ的表達差異均有統計學意義（F=84.355，P＜0.001）。與空白對照組比較，TGF-β1組CaMKⅡ蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與TGF-β1組比較，不同濃度KN62 處理組細胞中CaMKⅡ蛋白表達明顯減少（P＜0.05），且隨濃度增加，CaMKⅡ蛋白表達降低，差異有統計學意義（P＜0.001，圖3）。

2.5 不同處理組LX2-HSC內Bcl-2、Bax蛋白的表達不同處理組細胞中Bcl-2及Bax的表達差異均有統計學意義（F=110.896，P＜0.001；F=156.086，P＜0.001）。與空白對照組和TGF-β1組相比，不同濃度KN62 處理組細胞中Bcl-2蛋白表達明顯均減少（P＜0.001），Bax蛋白表達均明顯增加，且Bcl-2/Bax的比值顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.001，圖4）。

2.6 不同處理組LX2-HSC內caspase-12蛋白的表達不同處理組細胞中procaspase-12和cleaved caspase-12的表達差異均有統計學意義（F=115.654，P＜0.001；F=217.927，P＜0.001）。不同濃度KN62 處理組與TGF-β1組比較，procaspase-12和cleaved caspase-12蛋白表達增高（P＜0.001），且隨KN62 濃度的增加，LX2的細胞中procaspase-12和cleaved caspase-12蛋白表達升高（P＜0.001，圖5）。

3 討論

圖2 不同處理組人HSC 凋亡情況Fig.2 The apoptosis changes of human hepatic stellate cell in different treatment groups

目前認為，TGF-β1為肝臟中最強的促纖維化因子[12]。研究[13]表明，抑制TGF-β1及阻止CaMKⅡ的激活后消除了TGF-β刺激的膠原蛋白、纖連蛋白和α平滑肌肌動蛋白的表達。CaMKⅡ的表達及其活性在介導ERS凋亡途徑中發揮重要調節作用，且參與多種器官纖維化的發生發展[14-15]。BIAN 等[16]發現，由四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化模型中，ERS 調控細胞凋亡時，通過ERS 相關蛋白及肝纖維化因子表達等影響肝纖維化的發展進程。為此，本研究應用CaMKⅡ抑制劑KN62 作用于TGF-β1刺激的LX2，探討CaMKⅡ在肝纖維化發生發展過程中能否介導ERS 凋亡途徑進而影響HSC 增殖及凋亡過程。

ZHAO 等[17]發現，CaMKⅡ在人臍靜脈內皮細胞中具有重要的生理調節功能，抑制其活性后，顯著降低了內皮細胞增殖。LUO 等[18]報道，在CaMKⅡ抑制劑KN62的作用下減弱了去甲腎上腺素誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖。本研究顯示，1、5、10 μmol/L KN62均能抑制細胞增殖，隨KN62濃度的增加增殖率降低。表明KN62能夠抑制TGF-β1刺激的LX2細胞增殖，提示CaMK II參與HSC的增殖調控過程，其特異性抑制劑KN62可以阻抑LX2細胞增殖。

Bcl-2是重要的抑制凋亡蛋白，Bax是促進細胞凋亡的重要分子，Bcl-2和Bax 兩種凋亡調控蛋

圖3 不同處理組人HSC 中CaMKII蛋白的表達Fig.3 The expressions of CaMKII in human hepatic stellate cell different groups

圖4 不同處理組人HSC 中Bcl-2、Bax蛋白的表達Fig.4 The expressions of Bcl-2 and Bax in human hepatic stellate cell different groups

圖5 不同處理組人HSC 中caspase-12蛋白的表達Fig.5 The expressions of caspase-12 in human hepatic stellate cell different groups

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與TGF-β1組比較，#P＜0.05；與KN62 低濃度+TGF-β1組比較，□P＜0.05；與KN62 中濃度+TGF-β1組比較，△P＜0.05白保持平衡狀態，是誘導細胞凋亡的關鍵[19]。有報道[20-21]，HSC 中Bcl-2和Bax在肝纖維化和慢性肝病的發展進程中都發揮了重要作用，但具體作用機制尚不明確。而MIN 等[22]發現，通過抑制CaMKⅡ的磷酸化來抑制新生兒缺氧缺血性神經元損傷中的促凋亡信號通路，可增加Bcl-2/Bax蛋白比值。本研究結果顯示，不同KN62藥物濃度處理組CaMKⅡ的表達明顯低于空白對照組和TGF-β1組，Bax蛋白表達均顯著升高，Bcl-2蛋白表達則明顯降低，且隨藥物濃度增加Bcl-2/Bax的比值隨之減少，提示誘導細胞進入凋亡程序。從本研究細胞凋亡實驗也可看出不同KN62 藥物濃度處理組均明顯促進了LX2細胞凋亡，且隨KN62 濃度的增加，LX2的細胞凋亡率增高，說明抑制CaMKⅡ表達后可以促進TGF-β1刺激的LX2細胞的凋亡，進而延緩肝纖維化的發展。

本課題組之前通過體外實驗已證實ERS可以促進HSC細胞凋亡，改善肝纖維化的發展進程[23]。Caspase-12是caspase 家族中僅在ERS 通路中被活化的促凋亡蛋白，ERS 誘導細胞凋亡時，caspase-12表達上調，激活促細胞凋亡信號通路，啟動凋亡反應[24]。Caspase-12 本身以無活性的酶原形式procaspase-12存在，激活后轉變為有活性的cleaved caspase-12。ERS 早期通過誘導未折疊蛋白應答恢復細胞穩態起保護作用，procaspase-12蛋白表達增加；隨著ERS 時間延長，cleaved caspase-12蛋白表達增加，從而誘導細胞走向凋亡。本研究中，隨著CaMKⅡ抑制劑KN62 濃度的增加，procaspase-12及cleaved caspase-12蛋白表達增加，且明顯高于空白對照組和TGF-β1組，表明KN62 增加了促凋亡蛋白caspase-12的表達。

本研究發現CaMKⅡ抑制劑KN62 能夠抑制LX2 增殖并誘導其凋亡，可能與caspase-12 依賴性ERS 途徑有關，提示抑制CaMKⅡ其表達可能參與介導ERS 而使HSC 進入凋亡程序，以有效改善肝纖維化，可為臨床肝纖維化治療提供新的作用靶點。但本實驗僅探討了CaMKⅡ在抗纖維化的可能作用機制，有關抑制CaMKⅡ介導ERS 何種途徑促進HSC 凋亡，以及CaMKⅡ抑制劑對ERS 凋亡途徑的確切作用機制接下來將做進一步研究。