NEDD8和PD-L1在人腦膠質瘤組織中的表達及臨床意義

張恒威，王新軍，付旭東，周少龍，楊卓，張旭陽，曾凡濤，劉婉清

（鄭州大學第五附屬醫院 神經外科，河南 鄭州）

0 引言

腦膠質瘤是中樞神經系統中最常見的腫瘤，發病率高、死亡率高[1]。目前膠質瘤的發病機制尚不明確，臨床上膠質瘤患者的治療效果并不理想[2]。神經前體細胞表達下調因子 8(neural precursor cell-expressed developmentally down regulated 8，NEDD8)是機體內一種具有重要功能有類泛素蛋白。NEDD8通過一系列酶促反應后可與底物蛋白共價結合，調節底物蛋白生物性質，這一過程稱之為Neddylation[3]。大量研究證實，NEDD8的過表達與人類多種惡性腫瘤的發生、發展有關，如多發性骨髓瘤、結腸癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等[4]。程序性死亡配體1(programmed death-ligand 1， PD-L1)是位于人染色體9q24的跨膜蛋白,是B細胞、T細胞及單核細胞表面程序性死亡分子1(programmed death-1 PD1)的配體[5]。已有研究表明，PD-L1在多種惡性腫瘤中高表達,并通過激活PD1/PD-L1信號通路減弱機體免疫細胞的致死率，使惡性腫瘤細胞躲過機體免疫系統的監控和殺傷，從而增進腫瘤的發生和發展，如肺癌、肝癌、乳腺癌等[6]。目前關于NEDD8和PD-L1在腦膠質瘤組織中表達情況的報道不多，對于二者在腦膠質瘤組織中的表達是否存在相關性的探索更少。本研究旨在通過對NEDD8和PD-L1在80例不同級別膠質瘤組織標本及30例減壓腦組織標本中的表達情況的分析，進一步的揭示，NEDD8和PD-L1在膠質瘤的發生、發展中所起的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2015年01月01日至2018年03月01日在鄭州大學第五附屬醫院神經外科接受手術治療的80位膠質瘤患者的石蠟標本。納入標準:①初發病例且首次手術治療；②手術治療前未接受放射性療、化療及免疫治療；③所有標本均經病理學確診為膠質瘤，且患者臨床資料完整。排除標準：①患者或患者家屬拒絕參與研究；②各種原因導致的患者膠質瘤標本丟失。80位患者中男 46例，女 34 例；中位年齡 40(17～78)歲，其中＜40歲29例，≥40歲51例；患者術前頭顱MRI顯示：21例腫瘤位于枕葉，22例位于顳葉，37例位于額葉；80例膠質瘤組織標本，參照2007版世界衛生組織中樞神經系統腫瘤分類系統，星型膠質細胞瘤33例，少突膠質細胞瘤25例，膠母細胞瘤22例。低級別膠質瘤(1ow grade gliomas，LOG)27例，高 級 別 膠 質 瘤(high grade gliomas，HGG)53例。另選取同期因顱腦損傷于該院行“去骨瓣減壓術”的30位患者的減壓腦組織作為對照。標本取得后置于-800C冰箱冷凍保存。本研究經鄭州大學第五附屬醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

NEDD8兔單克隆抗體購于北京索萊寶科技有限公司（貨號BS-10222R）、兔多克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司（貨號PV-900）；PD-L1兔單克隆抗體購于Cell Signaling公司(貨號13684T)、兔多克隆抗體CMTM6購于Abcam公司(貨號ab198284)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色液、NC膜等實驗試劑均購于武漢賽維爾生物有限公司。

1.3 免疫組織化學法檢測膠質瘤組織及對照腦組織NEDD8和PD-L1表達

取手術切除對照腦組織常規制作石蠟標本。膠質瘤石蠟標本與對照腦組織石蠟標本5μm厚連續切片。切片貼敷于經過防脫劑處理過的載玻片上，滴加NEDD8和PD-L1單克隆抗體，4℃孵育過夜；PBS洗滌，滴加多克隆抗體；室溫孵育30min后再次使用PBS沖洗，然后滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液；室溫下再次孵育30min后加二氨基聯苯胺顯色液顯色，沖洗后蘇木素復染，采用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。用PBS液染色替換一抗，做陰性對照切片。切片制作全部完成后，置于顯微鏡下觀察。在常規顯微鏡視野（×200）下，選擇每張切片免疫應答最典型區域，并在高倍視野（×400）中隨機觀察5個非重復視野。計數 NEDD8和PD-L1染色細胞及視野中全部細胞數。其中陽性細胞百分比≤25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；根據染色程度評分：陰性者0分，淡黃色者1分，黃色或棕黃色者2分，褐色者3分。最后以兩者評分的總和為最終評分，2～6分為陽性，否則為陰性。

1.4 Western Blot檢測膠質瘤組織NEDD8和PD-L1表達

取冰凍組織 300 mg切碎，置于勻漿器中以充分裂解組織中的NEDD8和PD-L1，以Western Blot標準操作步驟進行，檢測出NEDD8和PD-L1表達量。實驗重復3次。

1.5 統計學方法

所有數據分析由SPSS 22.0軟件完成。計量資料用平均數±標準偏差）表示。NEDD8和PD-L1在試驗組與對照組腦組織中陽性表達率采用χ2檢驗比較；兩獨立樣本t檢驗用于比較不同病理級別膠質瘤NEDD8和PD-L1表達；采用χ2檢驗或Fisher精確概率法分析試驗組NEDD8和PD-L1表達與患者年齡、性別、膠質瘤病理類型、膠質瘤位置、膠質瘤直徑、膠質瘤病理級別的關系；利用列聯系數分析試驗組膠質瘤組織中 NEDD8和PD-L1表達的關聯性。檢驗水準均為a=0.05。

2 結果

2.1 免疫組織化學法檢測NEDD8和PD-L1的表達

NEDD8在細胞質和細胞核中都有表達，顯微鏡下觀察，陽性細胞染色呈淡黃色至棕褐色不等。PD-L1表達于細胞質和細胞膜，顯微鏡下觀察，陽性細胞染色亦是呈淡黃色至棕褐色不等。試驗組NEDD8和PD-L1陽性表達率分別為85.00%，78.75%，對照組NEDD8和PD-L1陽性表達率分別為30.00%，13.33%，由此可見NEDD8和PD-L1在膠質瘤組織中的表達明顯高于在對照腦組織中的表達（P均＜0.001），如圖1、表1。

表1 NEDD8和PD-L1在對照腦組織和膠質瘤組織中的表達情況

2.2 Western Blot檢測NEDD8和PD-L1表達

如圖2、表2所示，HGG組NEDD8和PD-L1表達水平高于LOG組的表達水平(P均＜0.001)。

圖1 不同病理級別膠質瘤組織和對照腦組織中NEDD8和PD-L1 的表達（SP,×400）A: 對照腦組織NEDD8表達; B:低級別膠質瘤NEDD8表達; C:高級別膠質瘤NEDD8表達; D: 對照腦組織PD-L1表達; E:低級別膠質瘤PD-L1表達; F: 高級別膠質瘤PD-L1表達

圖2 不同病理級別膠質瘤組織中NEDD8和PD-L1的表達

表2不同病理級別膠質瘤組織中 NEDD8和PD-L1 表達水平

2.3 試驗組膠質瘤組織中NEDD8和PD-L1的表達與相關臨床因素的關系

經過分析，試驗組膠質瘤組織中NEDD8和PD-L1的表達與膠質瘤病理級別、腫瘤直徑有關系（P均＜0.05），而與病人年齡，性別，腫瘤部位，腫瘤細胞類型均無關系（P均＞0.05）。隨著膠質瘤病理級別升高、腫瘤直徑增大，NEDD8和PD-L1的陽性表達率均增高（P均＜0.05），如表3所示。

2.4 試驗組膠質瘤組織中 NEDD8和PD-L1表達水平的關聯性

試驗組膠質瘤組織中NEDD8表達水平與 PD-L1 表達水平呈正相關，如表4所示。

表4 試驗組膠質瘤組織中NEDD8和PD-L1 表達水平的關聯性分析

3 討論

膠質瘤是神經膠質細胞惡性腫瘤，具有高組織學異質性和組織侵襲性等特征，膠質瘤多數發展為彌漫性腫瘤，廣泛浸潤腦實質，嚴重影響患者腦功能，最終危及患者生命[7]。目前膠質瘤的治療選擇有限，對新診斷的膠質瘤常行最大安全范圍的手術切除，輔以放療、化療。由于膠質瘤浸潤能力強，常無法完全清除，致使腫瘤極易復發，患者最終預后較差，尤以膠質母細胞瘤預后最差，中位生存時間為12-15個月，5年生存率僅為5%[8]。NEDD8和PD-L1可能作為重要因素協同參與膠質瘤的發生、發展。

類泛素蛋白（Ubiquitin-like proteins，UBLs）是機體內一類有重要功能的蛋白質，具有與泛素類似的序列和空間結構。泛素及類泛素蛋白參與的翻譯后修飾過程，幾乎貫穿于細胞內的所有調控途徑[9]。神經前體細胞表達下調因子 8(NEDD8)是由81個氨基酸編碼的類泛素蛋白，是目前研究發現的與泛素最近似的蛋白[10]。正常細胞生理過程中，NEDD8的主要功能是保持蛋白質的穩定性、增強或者減弱其特異性底物蛋白的活性和參與轉錄的調節等[11]。研究表明，NEDD8的底物中包含多種腫瘤相關蛋白、抑癌因子、調控基因表達過程的轉錄因子，如p53、鼠雙微體基因（murine double mimute2，MDM2）、希佩爾林道基因（Von Hippel-l indau，VHL）和 Cullin 家 族（Cul-lin-Ring E3 ligases，CRLs）等，NEDD8過表達會造成肝癌、乳腺癌、肺癌等的發生、發展[12]。

近幾年，關于腫瘤細胞如何引起免疫逃逸的相關機制研究，取得了很多突破性的進展，其中PD-1/PD-L1途徑是眾多成果中研究相對較深的機制之一[13]。PD-L1由機體CD274基因編碼，是程序性死亡分子1(programmed death-1 PD1)的配體。生理情況下PD-L1 與 PD-1 結合后，PD-1向機體免疫系統遞送抑制性信號，調節淋巴細胞的功能，防治自身淋巴細胞攻擊自身抗原，避免自身免疫性疾病的發生[14]。腫瘤細胞高表達PD-L1，通過激活此通路，抑制T淋巴細胞增殖，促進調節性T細胞( regulatory T cell，Treg)的生成，進而達到抑制機體免疫系統的目的[15～16]。目前Treg細胞在腫瘤組織中所起的作用很受關注，有研究報道Treg細胞可以導致免疫抑制、免疫無功能，進而促進多種癌細胞的生長和轉移[17]。

本研究表明，NEDD8和PD-L1在試驗組膠質瘤組織中高表達，隨著膠質瘤病理級別升高、腫瘤直徑的增大表達上調更明顯，且試驗組膠質瘤組織NEDD8表達水平與 PD-L1 表達水平呈正相關。由此我們猜測NEDD8和PD-L1高表達協同促進膠質瘤的惡變以及向周圍侵襲性生長，NEDD8和PD-L1可能作為重要的因素參與膠質瘤的發生、發展，二者有可能成為衡量膠質瘤惡性程度的蛋白標志物。大量研究報道揭示，NEDD8活化酶E1 有希望成為抗腫瘤藥物的新靶點，其中MLN4924作為 NEDD8 修飾的特異性抑制劑，已在臨床上證實可以抑制結腸癌、肺癌、多發性骨髓癌等多種腫瘤細胞的惡性生長[18]。同樣以PD-L1為靶點的靶向藥物，已在臨床上開始應用，且已經證實對腎癌、宮頸癌、非小細胞癌患者有效[19]。目前我們研究團隊已經證實[20]，動物及體外實驗中，通過減少NEDD8和PD-L1的表達，能有效的抑制膠質瘤細胞的生長、增殖，協同使用NEDD8和PD-L1抑制劑，膠質瘤受抑制效果更加顯著。臨床上能否通過抑制NEDD8和PD-L1高表達，使膠質瘤患者預后得到良好改善，需要進一步的探索。

綜上所述，此次研究主要探討了NEDD8和PD-L1在膠質瘤中的表達情況及與相關臨床因素的關系，未涉及NEDD8和PD-L1影響膠質瘤發生、發展的具體機制，后續會做進一步探索加以闡明。下一步將首先從NEDD8和PD-L1對膠質瘤患者預后的影響著手開始新的研究，更深層次的發掘NEDD8和PD-L1的臨床應用價值。