扶正祛痰丸治療支氣管哮喘患者對外周血Th17/Treg細胞因子的影響

徐建升

(東營市東城醫院，山東 東營）

0 引言

現代研究認為，支氣管哮喘是一種慢性呼吸道的炎癥，致病原因是由于T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等多種細胞因子參與的頑固性呼吸道疾病[1]，臨床癥狀以氣道高反應性，氣道氣流受限為主要特征，表現為喘息、胸悶、氣急和咳嗽等。西醫傳統理論認為支氣管哮喘的免疫學發病機理和輔助性T細胞的Th1、Th2細胞亞群之間比例失衡是有關[2]，隨著近幾年的研究很多學者發現哮喘患者痰液中檢查出了數量很多的中性粒細胞，Th1/Th2失衡論已經不能很完整的解釋這一現象[3]。TH17細胞是新發現的CD4+T亞細胞群，現在研究已經證實，哮喘患者發病過程中，Th17細胞分泌的IL-17數量明顯增多，而Treg細胞（調節性T細胞）表達的轉錄因子叉頭蛋白3反而減少明顯，導致Th17/Treg比例失衡，能夠調節免疫反應，使哮喘的病機得到進一步的補充，對臨床治療支氣管哮喘的療效觀察有了更完善的指導。

中醫認為，哮病發病的根本病因是“肺脾虛弱，腎氣不足”，發病的外邪主要是“夾痰、夾瘀及氣逆”等原因。中醫藥治療支氣管哮喘，能夠控制哮喘發作的次數以及在發病程度上都會有很大的改善，從而提高患者生活質量。筆者在從事臨床中醫過程中，立足前人“未病先防，既病防變”的宗旨，以“補益脾胃、固護腎陽”為基礎的治療法則，配伍中更加重視祛痰、理氣以治標，采用“扶正祛痰”為立方原則，對支氣管哮喘進行干預，通過本實驗以Th17/Treg為出發點，觀察其在臨床治療支氣管哮喘的臨床療效，為其推廣應用提供現代科學依據。報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇我院中醫科支氣管哮喘患者66例，診療時間源于2016年12月至2018年5月期間門診患者，年齡階段在6歲—70歲之間，病程1～15年之間；隨機抽取男女，所取病例都達到支氣管哮喘緩解期的中西醫診斷標準。中醫癥候屬哮病緩解期肺、脾、腎三虛夾雜痰郁氣逆型。無接受任何激素和免疫治療者；依從性好，能夠配合本次研究者。排除哮喘合并支氣管擴張、慢阻肺等慢性呼吸道疾病患者；類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡等慢性免疫炎癥性疾病患者；并且合并嚴重心、肝、腎功能不全者；精神異常者。

1.2 研究方法

1.2.1 配方如下

僵蠶90g、蟬蛻90g、五味子180g、炒杏仁90g清半夏90g、 防風90g、代赭石120g、黃芪180g、紫石英180g、白術120g、茯苓120g、麻黃90g、桔梗90g、厚樸120g、膽南星90g、甘草60g。以上諸藥按照水煎法要求久煎兩遍，分階段分別用武火、文火等慢慢將所提取的藥液濃縮至流浸膏，再按照流浸膏制造濃縮丸的制造要求將藥品制成1000丸分瓶儲存。由東營市東城醫院制劑室承擔。

1.2.2 配制中藥濃度

取配方中藥制好的的流浸膏濃縮丸適量，用二甲基亞砜(DMSO)將中藥丸稀釋并做成0.1mmol/L濃度的液態狀備用。

1.2.3 主要試劑

人IL-25試劑盒、人IL-17試劑盒、、人IL-35試劑盒、人IL-10試劑盒；24孔培養板；青蒿素（Art純度98%）；RPMI-1640完全培養液；DMSO；人外周血中淋細胞的分離液巴；淋巴細胞刺激劑。

1.2.4 主要設備

超凈工作臺；-80℃冰箱；加液槍；自動雙重純水蒸餾器；CO2培養箱（；TDZ5-W5型號多管架自動平衡離心機。

1.2.5 采集標本與分離淋巴細胞

1）準備真空采血肝素鋰真空抗凝管6組，并分別標識健康人、哮喘急性期、哮喘緩解期，三組人員清晨空腹于肘窩采外周靜脈血，分別按組將采集血存于肝素真空抗凝管內。

2）將配好的0.1mmol/L濃度的液態中藥治療液用RPMI-1640培養液稀釋成0.16umol/mL的濃度比。

3）首先采集入選者的外周靜脈血，根據密度梯度離心的方法，先將抽取的外周血液配制成PBMCs液，然后根據實驗需求全部用RPMI-1640培養液把PBMCs液調配成密度是2×107個/mL的實驗用血，將入選的三組哮喘患者的PBMCs每組都分別分成2組，共6組，將他們分別加入每一組是24孔培養板內，緩解期、急性期哮喘患者標本的PBMCs分別放兩個孔，再將1m L的PBMCs液注進每個孔內，在健康組每個孔中注入2ul的細胞刺激劑和10ul的RPMI-1640培養液，在緩解期與急性期哮喘患者兩個孔中都加入細胞刺激劑2ul、分別加入扶正祛痰丸(0.16umol/m L)10ul和RPMI164培養液10ul。

4）將加入了患者血樣標本的培養板全放進孵箱中，按照要求將溫度設為37℃，內含有5%CO2，繼續將樣本培養24小時后，再將培養板孔中PBMCs液收集起來，并分別標注好，放進備好的相對應的空管內，用轉速為3000 r/分的離心機，快速離心20，標本的上面會分離出清亮液體，將清亮液體注進1.5m LEP管內，保存在零下80℃的冰箱中備用。

1.2.6 檢測炎癥細胞因子

1）將保存在-80℃冰箱里的PBMCs上清液標本解凍，并按照酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒上的要求操作，慢慢恢復常溫。

2）將所有標本在420nm的吸光光度儀上進行OD值檢測；

3）根據試劑要求，用ELISA軟件包統計出各組IL-10、IL-17、IL-25、IL-35炎癥因子的濃度水平，對數據進行分析，最后得出結果。

1.2.7 統計學方法

采用 SPSS 18.0 軟件包對實驗所得數據進行的統計學處理，計量資料數據在滿足正態分布和方差齊性的前提下，以均數±標準差s）論述，技術資料檢驗用χ2表示，當P＜0.05 時認為有統計學意義，組間外比較使用單因數方差分析(ANOVA)，組間內采用 LSD-t 檢驗進行分析比較。

2 結果

2.1 入選者一般情況

根據三組患者的臨床資料進行對比，情況見下列表1。

表1 三組患者一般情況

2.2 健康對照組，急性期、緩解期哮喘患者發病和在治療后在實驗所得外周血清Th17/Treg細胞分泌的炎癥因子濃度分析對比，情況見表2

表2 健康組和扶正祛痰丸對兩組支氣管哮喘血清中細胞因子Th17/Treg結果比較分析(±s )(pg/mL)

Th17細胞在1640干預時分泌的IL-17、IL-25細胞因子在緩解期和急性發作期組的濃度比健康組的值升高(P＜0.05)，細胞因子濃度升高在急性期組較其他兩組更顯著(P＜0.05)；IL-10、IL-35細胞因子濃度比正值在緩解期和急性加重期比正常組低，降低也更明顯（P＜0.05)。經扶正祛痰丸治療后，緩解期與急性發作組中Th17細胞分泌的IL-17、IL-25細胞因子的濃度降低(P＜0.05)，急性發作期組中IL-17、IL-25的濃度水平比緩解期組數據降低的幅度更大(P＜0.05)；經1640干預的Treg細胞分泌的IL-10、IL-35的濃度比哮喘急性發作期組、哮喘緩解期組測得濃度比數據結果都明顯升高(P＜0.05)(見表2）。

3 分析與討論

支氣管哮喘是患者特稟體質造成自身免疫失衡的一種疾病，在各種內外因素的結合下，Th細胞容易出現漂移，不同的Th亞群能夠分泌獨特的細胞因子影響著患者的氣道炎癥哮喘的發病與炎癥反應有密切關系。自人們首次發現新型細胞亞群—Th17細胞以來，眾多學者對其在疾病治療以及其與調節性T細胞的關系進行了研究，已經證實Treg細胞和Th17細胞與支氣管哮喘發病有密切的關系。Th17/Treg細胞失衡學說成為繼Th1/Th2失衡之后對支氣管哮喘更新的詮釋。Th17細胞在促進自身免疫反應中能夠發揮重要作用，并參與了感染性疾病和自身免疫疾病.IL-25、IL-27、IL-35等對Th17細胞有抑制作用。IL-17是一種促炎因子，更是Th17細胞重要的效應因子,是在體內備受關注的受體，在哮喘患者中都檢測到了IL-17的明顯表達。Treg細胞是具有免疫調節作用的專門的抑制細胞，是重要的調節呼吸道炎癥的內院細胞。在免疫反應中能夠保護和避免機體過度反應，也能夠利用抑制炎癥細胞的釋放改善對組織的損傷，在自身免疫中地位很重要，能夠調節呼吸道黏膜吸入抗原產生耐受，能夠減少氣道EOS減弱氣道的炎癥，從而產生哮喘。有研究表明在哮喘患者外周血中，Treg細胞的功能下降，數量和分泌的細胞因子水平也減少。

中醫對支氣管哮喘急性期的傳統治療以宣肺理氣、祛風化痰為主，緩解期的治療重點在于扶正固本。很多醫家在治療支氣管哮喘急性發作期時，不兼顧患者素虛的體質，緩解期的治療認識不到祛伏痰、理氣滯的重要性，所以在臨床對該病的治療效果并不理想。扶正祛痰丸立方原則既重視患者素虛的體質，又考慮邪氣存內是誘發的重要外因，選用即能扶正納氣，又能祛風化痰的中藥組方，故而取得了更好的療效。扶正祛痰丸的藥物組成是由具有健脾補肺益腎之功、有祛痰理氣之效、祛風解痙之力和巧妙的運用具有宣肺平喘作用的中藥組成。方子祛痰理氣為主也是篩選了具有輔助腎氣作用的治咳平喘的作用的中藥，所以是一個具有見效快、治病求本的治喘方劑。辯證上即重視肺、脾、腎三臟的虧虛，通過扶助正氣以杜絕痰的生成，治療上在各期都配伍了具有祛風、化痰、降氣作用的中藥，消除呼吸道內久伏之頑風老痰，達到邪已祛，正氣復，病情盡量做到少復發。

支氣管哮喘是有多種炎性細胞引起的呼吸道的高敏感性和氣道狹窄的呼吸道疾病，往往由于痰阻于肺道引起氣逆而致的喘息、呼吸困難、胸悶、咳嗽等呼吸道癥狀。治療支氣管哮喘祛痰的必要性在“百病皆由痰做崇”之說就能體現出來，故“欲治咳喘者，當以治痰為先”。扶正祛痰丸具有固氣攝納、宣肺平喘和祛痰理氣的特點。哮喘內存之頑痰只有傾其藥物全力，才有可能徹底的祛邪外出。扶正祛痰丸中的藥物成分經過多次臨床研究證實即能夠起到很好的祛痰止咳平喘的作用，又能夠提高機體免疫能力，增強人體抗過敏的作用，取得了很好的臨床療效。