電針大腸俞募穴對功能性腹瀉大鼠腸道褪黑素、5-HT水平的調控研究

王靜，羅丹妮，李修娟，張微，鄭倩華*，李瑛

（1.成都中醫藥大學針灸推拿學院，四川 成都；2.四川省中西醫結合醫院繼續教育部，四川 成都；3.成都中醫藥大學研究生院，四川 成都）

0 引言

功能性腹瀉（Functional Diarrhea，FD）是常見的消化系統疾病，以是排便次數增多，糞便性狀改變為主要臨床癥狀[1]。腹瀉癥狀，體現了腸道動力亢進。流行病學研究表明，FD在我國的發病率是1.54%[2]，美國成年人FD發病率為2.1%[3]。腹瀉癥狀的長期存在不僅可以引起其他的并發癥，也嚴重影響了患者的生活質量[4]。

研究表明，針灸治療胃腸道疾病效果顯著，針灸可減少患者排便次數、改善大便性狀，提高患者生活質量[5-7]。長期的臨床實踐及大量基礎研究均證實針灸治療FD的療效性和安全性[8]。古今大量文獻指出大腸俞募配穴是針灸臨床治療胃腸道疾病的常用配穴方法之一，針灸通過俞募穴對異常的腸道動力進行良性調節，令腸道動力回歸正常，從而令機體恢復內在平衡的穩態，起到治療作用。在對針灸治療腹瀉的選穴規律進行分析后亦可以看出俞募配穴法正是臨床治療FD的常用配穴方法[9]。近年來，在國家“973計劃”項目研究中也發現針刺大腸俞募穴可減少腹瀉次數，緩解腹瀉相關臨床癥狀[10]。

研究發現，腸道的嗜鉻細胞（Entcrochromaffin cells，EC）合成、分泌的褪黑素（Melatonin，MT）與腸道動力密切相關，其水平高低與腸道動力方向有密切關系。在體及體外實驗證實，小劑量MT可促進腸道動力，但大劑量則抑制腸道動力。目前，MT作用于腸道動力的機制尚不清，可能與同為EC合成、分泌及儲存的腸道5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）及其信號系統功能有關。本研究以FD模型大鼠為研究對象，研究電針大腸俞募穴對FD大鼠腸道MT、5-HT水平的調控及對5-HT信號系統的影響，擬進一步闡釋電針調整FD大鼠異常腸道動力的生物學機制。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

SPF級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，由成都達碩實驗動物有限公司提供（動物生產許可證號：0018541），共30只，體重250-300克。使用普通級動物飼料飼養，飼養期間大鼠自由飲水與進食，光照周期12h:12h。大鼠購回后于動物實驗室進行為期一周的適應性飼養，隨后以SPSS軟件生成隨機號，將大鼠按照體重隨機分為以下3組：空白對照組（空白組）、功能性腹瀉模型組（模型組）、電針大腸俞募穴腹瀉組（電針組），每組10只。

1.2 實驗儀器及試劑

1.2.1 主要試劑

濃度為0.3g/mL的番瀉葉（購于成都中醫藥大學附屬醫院門診中藥房），生理鹽水（成都科倫藥業有限公司），7%水合氯醛(成都科龍化工試劑公司，生產日期：20140427)，酶聯免疫吸附測定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：12.8ng/mL標準品（上海酶聯生物科技有限公司，貨號：mL302829）；標準品稀釋液（上海酶聯生物科技有限公司，貨號：mL302829）；酶標包被板（上海酶聯生物科技有限公司，貨號：mL302829）。

1.2.2 主要儀器

旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA）,恒溫水浴箱(上海市北儀器廠，TO-1-75)，臺式封閉電爐（天津泰斯特儀器有限公司，DL-1-15）,優普超純水制造系統（成都超純水有限公司，UPH-II-10T），一次性不銹鋼灸針（規格：0.25×13mm，蘇州華佗醫療器械廠），韓式電針儀（LH202H，北京力普康醫藥科技發展公司），電子天平（上海精密科學儀器有限公司，F-1000）。

1.3 功能性腹瀉大鼠模型的建立

參照相關文獻的方法[11]，模型組、電針組大鼠均采用以下方法建立FD模型。取番瀉葉360g，清洗浸泡30分鐘后，配6倍的清水（2160mL）進行加熱，沸騰后，繼續再煎煮10分鐘，紗布過濾，濃縮水煎液至1200mL（0.3g/mL）。分裝為10袋，置于-18℃冰箱保存。用時采取水浴加溫到28℃，均按10mL/kg劑量對模型組、電針組大鼠進行灌胃，每日1次，連續灌胃10天，期間大鼠可自由飲水與進食。評估造模前后大鼠的糞便性狀，包括24h總便粒數、稀便數、稀便率、稀便級、腹瀉指數，以判斷腹瀉模型制備成功與否。空白組大鼠每日同一時間行相應的抓握，并使用28℃的生理鹽水按10mL/kg劑量灌胃，期間自由飲水與進食。

1.4 干預方法

1.4.1 穴位選擇與定位

選取電針大腸俞募穴，即大腸俞和天樞穴進行電針治療。穴位定位標準參照《實驗針灸學》以及結合動物比較解剖學方法定位進行取穴治療[12]。大腸俞，在腰部，當第四腰椎棘突下，旁開約5mm。天樞，在腹部，臍中旁開約5mm。

1.4.2 干預操作

在造模開始第一天，進行番瀉葉水煎劑灌胃1小時后，即進行針灸治療，連續干預10天。采用自制鼠架固定大鼠后，充分暴露其腰腹部，剪去穴位所在部位毛發。皮膚經75%醫用酒精消毒后，以1寸針灸針刺入腧穴約5mm，采用平補平瀉手法捻轉行針1min后，接韓式電針儀，波形選擇疏密波，頻率為2/15Hz，電流強度為1.5mA，以大鼠肢體輕微抖動為度，留針20min，1次/日，連續治療10次。電針操作要求為每次治療時分別取同側俞募穴，于兩穴接電針正負極。左右俞募穴交替使用。空白組、模型組大鼠每日以相同方法抓握以及固定相同時間，但不接受任何治療。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 一般情況觀察

于造模開始至治療結束，每天固定時間對所有組別的大鼠進行精神狀態、皮毛色澤及活動度進行觀察。并測量每日體質量。

1.5.2 糞便性狀評估

于造模開始至治療結束，每天固定時間對大鼠的糞便性狀、氣味進行觀察，并于造模前、治療結束后，進行24h總便粒數、稀便粒數、稀便率、稀便級和腹瀉指數的計算：在以上各時間點對腹瀉模型組和電針大腸俞募穴腹瀉組進行本項目檢測。稀便率=大鼠的稀便粒數/大便的總粒數（稀便以濾紙上有無污跡為標），稀便級（根據濾紙上污跡范圍的大小分為4級：1級，污跡直徑＜1cm；2級，污跡直徑1-2cm，3級，污跡直徑2-3cm；4級：污跡直徑＞3cm）和腹瀉指數=稀便率×稀便級。

1.5.3 腸道MT、5-HT水平的檢測

治療結束后當天，禁食不禁水12h后，處死各組大鼠，開腹后快速取出回腸、近端結腸及遠端結腸（距肛門0.5cm），詳細標記組別及部位后,進行以下項目的檢測。

（1）腸道MT水平測定：將上述不同部位組織切碎后用生理鹽水稀釋10倍徹底勻漿，取勻漿上清液50μl，采用ELISA法檢測腸道組織中MT水平。

（2）腸道5-HT水平測定：按照以上（1）中所述方法分別對不同腸道組織進行采樣及處理，采用ELISA法檢測腸道5-HT水平。

1.6 數據分析

連續變量數據以均數±標準差表示，采用SPSS 19.0統計軟件包進行數據分析處理。各組數據經過正態檢驗和方差齊性分析后，采用單因素方差分析和t檢驗進行統計學處理。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

造模前各組大鼠皮毛緊密貼身、有光澤，雙眼有神，活動較多且敏捷，食欲較好。造模前后各組間體重差異無統計學意義（P＞0.05），造模前各組均無腹瀉情況，24h總便粒數差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠造模前體重和糞便情況比較（mean±SD）

2.2 24h總便粒數、稀便粒數、稀便率、稀便級和腹瀉指數比較

如表2，造模后，模型組大鼠24h稀便粒數、稀便率、稀便級、腹瀉指數均高于空白組（P＜0.05），各組大鼠24h總便粒數差異均無統計學意義（P＞0.05）；治療后，電針組24h稀便級明顯低于模型組（P＜0.05），與空白組差異無統計學意義（P＞0.05），電針組腹瀉指數與空白組、模型組相比差異有統計學意義（P＜0.05），電針組24h稀便粒數、稀便率與模型組相比差異無統計學意義（P＞0.05），各組大鼠24h總便粒數差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表2 治療后各組大鼠排便情況比較（mean±SD）

2.3 腸道MT水平情況

由表3可知，經ELISA檢測結果顯示，造模后，模型組結、回腸MT、水平明顯高于空白組（P＜0.05）。治療后，電針組結、回腸MT含量均低于模型組（P＜0.05），其中回腸MT水平和空白組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 造模后治療后結、回腸MT水平（mean±SD）

2.4 腸道5-HT水平情況

如表4所示，經ELISA檢測，造模后，模型組結、回腸5-HT水平明顯高于空白組（P＜0.05）；治療后，電針組結、回腸5-HT含量均低于模型組（P＜0.05），且和空白組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 造模后治療后結、回腸5-HT水平（mean±SD）

2.5 相關性分析

進一步分析2.3和2.4的數據結果，將回腸的MT和5-HT水平，結腸的MT和5-HT水平分別進行相關性分析，發現在治療結束后回腸5-HT和MT沒有相關性（r=0.256，P=0.305），而結腸5-HT和MT存在中等程度的正相關（r=0.537，P=0.022）。

3 討論

功能性腹瀉在臨床上是常見的腸道疾病之一，屬于中醫“泄瀉”范疇[13]。祖國傳統醫學大多認為泄瀉病位在腸道，病機涉及肝、脾、腎。飲食不節、情志所傷、感受外邪、脾胃虛弱等多種病因可導致機體腸道失司，脾失健運，水谷精微不布，停聚成濕，濕盛則脾病，而成泄瀉。現代醫學認為腹瀉是腸道動力亢進的表現。MT是由位于第三腦室后壁的松果體分泌的肽類激素，主要分布在神經系統中。在胃腸道中MT亦有分布，其主要是由胃腸道粘膜下分布的EC合成與分泌的[14]。研究發現MT參與了控制胃腸運動，有研究發現小劑量MT結合常規藥物治療消化不良，患者胃腸動力加快，癥狀明顯改善[15]。5-HT是一種聯系腦腸軸、參與調節胃腸道運動和分泌功能的重要神經遞質，大量的5-HT在腸道內聚集可導致中毒反應及其受體脫敏，從而出現胃腸道動力、分泌功能性及內臟高敏感性異常，與慢性便秘、IBS、腹瀉及功能性消化不良等胃腸道功能性疾病的發病密切相關[16]。石卿等在腸易激綜合征-腹瀉型（Diarrhea Predominated Irritable Bowel Syndrome，IBS-D）模型大鼠中發現，5-HT和MT水平均較空白對照大鼠升高，腸道內大量5-HT可以使腸道收縮力增強，收縮幅度降低，而預先使用大劑量MT處理過的活體標本，5-HT的作用亦減弱[17]。綜上，MT可能通過對5-HT信號系統的影響，調控腸道5-HT水平高低，從而控制胃腸運動功能。

針灸對FD的臨床療效確切，可良性調節異常腸道動力。而電針大腸俞募穴是針灸臨床治療功能性便秘和FD最經典、最常用的配穴方法。本研究選取大腸俞募穴，電針治療FD，觀察其對大鼠腸道MT、5-HT水平的影響。從中醫角度出發，大腸募穴為天樞，背俞穴為大腸俞，分別為大腸之氣輸注于胸腹及背腰的腧穴，兩穴相配，一前一后、一陰一陽，正如《難經本義》中所述“陰陽經絡，氣相交貫，臟腑腹背，氣相通應”，同時針刺兩穴可發揮相輔相成、臟腑同調、平衡陰陽，恢復臟腑正常功能的協同效應。

本研究通過番瀉葉水煎劑灌胃建立腹瀉模型，效果穩定，灌胃后即出現明顯稀便。但可能單純番瀉葉水煎劑灌胃所致的腹瀉，其自愈性較好，當停止灌胃后，模型消失[18]。因此本研究不能等造模成功后再進行干預，只能造模與治療干預同時進行。經ELISA法檢測大鼠結、回腸中MT、5-HT水平，結果表明模型組結、回腸MT、5-HT水平明顯高于空白組的健康大鼠，說明造模可導致大鼠結、回腸MT、5-HT水平異常升高。干預治療后，電針組24h稀便級、腹瀉指數、結腸和回腸MT、5-HT含量明顯下降，其中回腸MT、5-HT和結腸5-HT水平和空白組差不多，說明電針可降低腸道內MT和5-HT因造模升高的異常水平。進一步的數據的相關性分析中發現結腸的MT和5-HT存在中等程度的正相關。由此推測，電針大腸俞和天樞穴可能通過降低MT水平，減少對5-HT信號系統的干擾，促進5-HT的滅活，減少腸道內5-HT的含量，從而緩解腸道紊亂，改善腹瀉癥狀。

通過本研究，我們證實了電針治療FD療效確切，其機制與降低腸道內MT、5-HT水平有關。但電針治療通過調控MT水平如何影響5-HT及其信號系統還有待進一步研究，可考慮進一步檢測褪黑素受體（Melatonin receptor，MR）、5-HT轉運體（Serotonin transporter，SERT）等相關蛋白的表達情況，以闡釋更明確的生物學機制。