花椒中的異丁基酰胺化合物及其對HT22海馬神經元鐵死亡的抑制作用研究

張凱峰，賀鵬楊，何達海

西南民族大學藥學院，成都 610041

花椒ZanthoxylumbungeanumMaxim為蕓香科花椒屬植物，在中國分布廣泛，主要集中在云南、貴州、四川、西藏等省區，是傳統的調味品及中藥材。四川花椒用于治療腹痛、腹瀉和溫脾胃[1,2]。現代藥理學研究表明：花椒具有包括抗腫瘤、抗炎、治療I-型糖尿病等廣泛生物活性[3-5]。花椒果實為食用和中藥材取材部位，其化學成分豐富，文獻報道有異丁基酰胺類化合物[6-9]、生物堿類[10]、木脂素[11]、香豆素[12]、黃酮[12]、精油[13]等。其中的異丁基酰胺類化合物為其主要成分之一。因此，花椒中異丁基酰胺類化合物的結構分析以及活性研究，對花椒的食用安全和用藥安全具有重要意義。

瀘定縣位于四川省西部，二郎山西麓，該地區土壤、日照、熱量條件適宜花椒生長。本課題旨在深入研究該地區出產花椒的主要成分之一的異丁基酰胺類化合物，為其質量控制提供物質基礎，提升其食用科學性和用藥安全，從而提高其附加值，為當地花椒種植戶增加收入，提高他們的種植積極性。

我們從瀘定縣花椒的酸水浸提物中共分離并鑒定了8個異丁基酰胺類化合物和β-谷甾醇，其中化合物1雖然已經被合成出來，但作為天然產物尚屬首次。為了探究所分離得到的化合物的生物活性，化合物2～8對erastin誘導的小鼠海馬神經元細胞系HT22細胞鐵死亡的抑制作用，IC50為4.08 μM。

1 儀器與材料

質譜(HR-ESI-MS)則使用Waters Vion IMS QTof；核磁共振為Bruker，400和600 MHz，以Methanol-d4或CDCl3為溶劑，TMS為內標；制備色譜儀為江蘇漢邦DAC80，色譜柱為30 × 250 mm，薄層層析(TLC)硅膠(GF254)和柱層析硅膠(200～300目，青島海洋化工有限公司)用于柱色譜。反相色譜柱(Cosmosil 75，C18-OPN)為Nacalai Tesque 公司產品。葡聚糖凝膠Sephadex LH-20購自于當地代理商。TLC顯色劑用Wagner試劑(碘1 g和碘化鉀10 g溶于50 mL水中，加熱，加冰醋酸2 mL用水稀釋到100 mL)和硫酸香草醛試劑(香草醛0.5 g溶于100 mL硫酸-乙醇(1∶1)溶液)。實驗室所用的有機溶劑以及其它耗材等，從成都金牛化工試劑公司購買。

花椒原料于2018年9月采自四川省甘孜州瀘定縣，經王曉玲教授鑒定為ZanthoxylumbungeanumMaxim，樣本存放于西南民族大學少數民族藥物標本館(編號Zb-2018-1)。

2 分離與提純

將自然陰干的5 kg花椒粉碎(5～10目)，用1.5 L 70%乙醇水(鹽酸調節pH=3)常溫浸提24小時。抽濾得總浸提液，真空濃縮出去大部分乙醇，氨水調節pH=9～10，用石油醚和乙酸乙酯依次萃取，分別得石油醚萃取物80 g和乙酸乙酯萃取物330 g。石油醚萃取物用硅膠柱色譜常壓分離，石油醚-乙酸乙酯(4∶1→5∶1)梯度洗脫，得Zb-P-1～Zb-P-8共8個部分，Zb-P-4繼續用硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯4∶1等度洗脫，得化合物9(0.3g)；Zb-P-6用制備液相分離，色譜柱為Ф 30×250 mm，流動相A(甲醇)，流動相B(水)，洗脫條件為0～15 min(A 60%～95%)，15～18 min(A 95%～100%)，18～23 min(A 100%)，流速為35 mL/min，檢測波長為254 nm，得化合物7(12 mg)；Zb-P-7制備液相分離，方法同上，得到化合物6(20 mg)。乙酸乙酯萃取物用硅膠柱色譜(Ф 10×100 cm)氯仿-甲醇(12∶1→5∶1→1∶1)梯度洗脫，得到Zb-E-1～Zb-E-11共11個部分，硅膠柱色譜分離Zb-E-2，石油醚-乙酸乙酯1∶2等度洗脫，得化合物3(5 mg)；樣品Zb-E-3用硅膠柱色譜(Ф 8×80 cm)，乙酸乙酯-甲醇20∶1等度洗脫得到Zb-E-3-1～Zb-E-3-4共4個部分，Zb-E-3-1繼續用硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯1∶2等度洗脫得到化合物2(8 mg)、5(6 mg)和8(6 mg)；Zb-E-6硅膠柱色譜分離，方法同樣品Zb-E-3-1的分離，得到化合物4(9 mg)；樣品Zb-E-7用硅膠柱色譜分離，然后用高效液相色譜分離(方法同上述液相色譜方法)的混合物同分異構體Zb-E-725，高效液相色譜(甲醇-水35%)等度洗脫得到同分異構體1b(混有1a)和化合物1a(2 mg)。

3 活性測試

3.1 細胞培養

HT22 細胞置于含5% CO2、37 ℃恒溫箱中，使用含10% 胎牛血清的DMEM 培養基培養。

3.2 CCK-8實驗

參照文獻[14]方法略做修改，HT22細胞以10 000個/孔的密度接種于96孔板中，孵育過夜后，加入5 μM的化合物，預處理4 h。隨后加入1 μM的Erastin，繼續處理24 h。每孔中加入CCK-8 試劑10 μL，培養箱內，37 ℃孵育1 h，酶標儀上讀取450 nm 處的吸光值。細胞存活率每組按照以下公式計算。實驗重復3次。

細胞存活率=(處理組-空白對照組)/

(對照組-空白對照)×100%

3.3 細胞形態學觀察

在96 孔板中種植HT22 細胞，當細胞密度長到約為60%～70% 時，預處理藥物4 h，再加入1 μM Erastin 作用24 h后，在倒置顯微鏡下觀察相關細胞的形態，并拍照記錄。實驗重復3 次。

3.4 統計學分析

所有數據應用GraphPad Prim 6.0統計學軟件進行分析。

4 結構與鑒定

化合物1淺黃色油狀物；紫外254 nm有暗斑；Wagner試劑呈陽性；HR-ESI-MS:m/z292.223 7[M+Na]+(calculated for C16H31NO2Na，292.224 7)，m/z253.231 2[M-OH]+(calculated for C16H30NO，253.223 2)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)顯示兩個乙烯基質子δ：6.79(1H，dt，J=7.0，15.3 Hz，H-3)，5.98(1H，dt，J=1.4，15.3 Hz，H-2)，一個氨基取代次甲基3.25(1H，s，H-1′)，一個甲基0.89(1H，t，J=7.0 Hz，H-12)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：167.8(s，C-1)，144.7(d，C-3)，123.2(d，C-2)，70.2(s，C-2′)，49.7(d，C-1′)，31.2(t，C-6)，29.2(t，C-8)，29.1(t，C-10)，29.0(t，C-9)，28.8(t，C-7)，28.1(t，C-5)，25.8(q，C-3′，C-4′)，22.3(t，C-11)，13.0(q，C-12)。上述數據與文獻[15]報道合成化合物數據基本一致，化合物的被證實為(2E)-N-(2-hydroxy-2-methylpropyl)-dodec-2-enamide，該化合物被Menozzi-Smarrito等[14]首先合成出來。通過SCIfinder檢索顯示，該化合物作為天然產物尚屬首次[15,16]，命名為花椒素A(zanthoxylumol A)。

化合物2淺黃色油狀物；紫外254 nm有暗斑；Wagner試劑呈陽性；HR-ESI-MS:m/z286.178 3[M+Na]+(calculated for C16H25NO2Na，286.177 7)，m/z246.184 5[M-OH]+(calculated for C16H24NO，246.185 2)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：1.19(6H，s，Me-3′ and Me-4′)，1.78(3H，d，J=6.8 Hz，Me-12)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：167.6(s，C-1)，143.7(s，C-3)，133.3(s，C-9)，131.9(s，C-10)，129.5(d，C-11)，129.2(d，C-7)，129.1(d，C-6)，125.1(d，C-8)，123.7(d，C-2)，70.2(s，C-2′)，49.7(d，C-1′)，31.8(t，C-4)，26.2(t，C-5)，25.9(q，C-3′，C-4′)，17.0(q，C-12)。上述數據與文獻[9]報道基本一致，主要差異原因在于溶劑效應，文獻所用的氘代溶劑為氯仿，而我們用的氘代溶劑為甲醇。故鑒定化合物2為hydroxy-α-sanshool。

化合物3淺黃色油狀物；紫外254 nm有暗斑；Wagner試劑呈陽性；HR-ESI-MS:m/z318.242 1[M+Na]+(calculated for C18H33NO2Na，318.240 3)，m/z278.248 6[M-OH]+(calculated for C18H32NO，278.247 8)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.15(1H，dd，J=10.5，15.1 Hz，H-3)，6.01(1H，d，J=15.1 Hz，H-2)，1.20(6H，s，Me-3′ and Me-4′)，0.92(3H，t，Me-14)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：168.2(s，C-1)，142.8(d，C-5)，141.2(d，C-3)，128.4(d，C-4)，121.5(d，C-2)，70.3(s，C-2′)，49.8(s，C-1′)，32.6(t，C-6)，31.7(t，C-12)，29.3(t，C-8)，29.2(t，C-9)，29.0(t，C-10)，28.9(t，C-11)，28.6(t，C-7)，25.8(q，C-3′，C-4′)，22.3(t，C-13)，13.0(q，C-14)。上述數據與文獻[9]報道一致，故鑒定化合物3為tetrahydrobungeanool。

化合物4淺黃色油狀物；紫外254 nm有暗斑；Wagner試劑呈陽性；HR-ESI-MS:m/z312.194 1[M+Na]+(calculated for C18H27NO2Na，312.193 4)；m/z272.201 01[M-OH]+(calculated for C18H26NO，272.200 8)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：168.1(s，C-1)，141.8(d，C-5)141.0(d，C-3)，132.1(d，C-8))，131.7(d，C-12)，131.3(d，C-9)，131.1(d，C-10)，130.1(d，C-11)，128.8(d，C-13)，128.3(d，C-4)，121.8(d，C-2)，70.3(s，C-2′)，49.7(d，C-1′)32.5(t，C-6)，31.8(t，C-7)，25.8(q，C-3′，C-4′)，16.9(q，C-14)。上述數據與文獻[9]報道一致，故鑒定化合物4為hydroxy-γ-isosanshool。

化合物5淺黃色油狀物；紫外254 nm有暗斑；Wagner試劑呈陽性；HR-ESI-MS:m/z312.194 1[M+Na]+(calculated for C18H27NO2Na，312.193 4)，離子峰m/z272.201 0[M-OH]+(calculated for C18H26NO，272.200 8)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：168.1(s，C-1)，141.8(d，C-5)，141.0(d，C-3)，133.2(d，C-11)，131.9(d，C-12)，129.4(d，C-9)，129.3(d，C-8)，129.1(d，C-13)128.9(d，C-4)，125.2(d，C-10)，121.8(d，C-2)，70.3(s，C-2′)，49.7(d，C-1′)，32.6(t，C-6)，26.7(t，C-7)，26.0(q，C-3′，C-4′)，17.0(q，C-14)。上述數據與文獻[9]報道一致，故鑒定化合物5為hydroxy-γ-sanshool。

化合物6淺黃色油狀物；紫外254 nm有暗斑；Wagner試劑呈陽性；HR-ESI-MS:m/z314.208 9[M+Na]+(calculated for C18H29NO2Na，314.209 0)，m/z274.217 22[M-OH]+(calculated for C18H28NO，274.216 5)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：168.1(s，C-1)，142.0(d，C-5)，141.0(d，C-3)，131.3(d，C-11)，128.8(d，C-9)，128.6(d，C-4)，128.3(d，C-12)，126.8(d，C-8)，121.8(d，C-2)，70.3(s，C-2′)，49.8(d，C-1′)，32.5(t，C-6)，26.2(t，C-7)，25.8(q，C-3′，C-4′)，25.0(t，C-10)，20.1(t，C-13)，13.2(q，C-14)。上述數據與文獻[9]報道一致，故鑒定化合物6為(2E, 4E,8Z,11Z)-2′-hydroxy-N-isobutyl-2,4,8,11-tetradecatetraenamide(bungeanool)。

化合物7淺黃色油狀物；紫外254 nm有暗斑；Wagner試劑呈陽性；HR-ESI-MS:m/z296.199 4[M+Na]+(calculated for C18H27NONa，296.198 4)，m/z274.217 22[M+H]+(calculated for C18H28NO，274.216 5)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：167.1(s，C-1)，141.5(s，C-5)，140.6(d，C-3)，133.2(d，C-11)，131.9(d，C-12)，129.4(d，C-9)，129.3(d，C-8)，129.1(d，C-13)，128.9(d，C-4)，125.2(d，C-10)，122.0(d，C-2)，46.7(d，C-1′)32.6(t，C-6)，28.4(d，C-2′)，26.8(t，C-7)，19.2(q，C-3′，C-4′)，17.1(q，C-14)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：166.3(s，C-1)，141.8(d，C-5)，140.0(d，C-3)，133.4(d，C-11)，131.8(d，C-12)，130.0(d，C-9，C-13)，129.5(d，C-8)，128.7(d，C-4)，125.4(d，C-10)，122.2(d，C-2)，46.9(d，C-1′)，33.0(t，C-6)，28.6(d，C-2′)，27.1(t，C-7)，20.1(q，C-3′，C-4′)，18.3(q，C-14)。上述數據與文獻[9]報道一致，故鑒定化合物7為γ-sanshool。

化合物8淺黃色油狀物；紫外254 nm有暗斑；Wagner試劑呈陽性；HR-ESI-MS:m/z314.208 9[M+Na]+(calculated for C18H29NO2Na，314.209 0)，m/z274.217 22[M-OH]+(calculated for C18H28NO，274.216 5)；顯示其中含有化合物5；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：168.1(s，C-1)，142.0(d，C-5)，141.0(d，C-3)，132.0(d，C-11)，128.8(d，C-9)，128.5(d，C-4)，128.3(d，C-12)，127.0(d，C-8)，121.8(d，C-2)，70.3(s，C-2′)，49.8(d，C-1′)，32.6(t，C-6)，29.9(t，C-10)，26.2(t，C-7)，25.8(q，C-3′，C-4′)，20.1(t，C-13)，12.9(q，C-14)。上述數據與文獻[9]報道一致，故鑒定該化合物為(2E,4E,8Z,11E)-2′-hydroxy-N-isobutyl-2,4,8,11-tetradecatetraenamide(isobungeanool)。

化合物9白色針狀晶體；噴灑硫酸香草醛試劑加熱顯暗紅色；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.53(1H，m，H-3)，5.37(1H，d，J=4.4 Hz，H-6)，1.03(3H，s，Me-19)，0.93(3H，d，J=6.6 Hz，Me-21)，0.87，0.84，0.82(3×3H，s，Me-26，27，29)，0.70(3H，s，Me-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.3(t，C-1)，31.7(t，C-2)，71.8(d，C-3)，42.3(t，C-4)，140.8(s，C-5)，121.7(d，C-6)，31.9(t，C-7)，31.9(t，C-8)，50.1(d，C-9)，36.5(s，C-10)，21.1(t，C-11)，39.8(t，C-12)，42.3(s，C-13)，56.1(d，C-14)，24.3(t，C-15)，28.3(t，C-16)，56.8(d，C-17)，11.9(q，C-18)，19.4(q，C-19)，36.2(d，C-20)，18.8(q，C-21)，34.0(t，C-22)，26.1(t，C-23)，45.8(d，C-24)，29.2(d，C-25)，19.8(q，C-26)，19.0(q，C-27)，23.1(d，C-28)，12.0(q，C-29)。上述數據與文獻[17]報道一致，故鑒定化合物9為β-為谷甾醇。

5 HT22鐵死亡抑制活性測試結果

化合物1的量太少，沒有進行生物活性測試。化合物2～8接受了對HT22小鼠海馬神經元鐵死亡抑制活性測試。

HT22 細胞板培養24 h 后，普通倒置顯微鏡下觀察發現未加入Erastin的正常HT22 細胞貼壁生長，細胞呈兩極或多極，突起明顯，突起之間相互交織成網狀，細胞膜光滑且完整，胞體折光性強(圖1A)。加入1 μM Erastin誘導細胞損傷24 h后，細胞生長被抑制，誘導損傷后形態學顯示，胞體軸突減少，細胞皺縮，胞質凝聚，細胞間連接減少，細胞貼壁不緊，胞體折光性下降有明顯的收縮(圖1B)；同樣損傷后，采用5 μM的化合物3干預24 h，對比發現化合物3組與空白對照組(圖1B)相比，細胞數目回升，細胞形態改善，細胞的收縮程度也有所恢復，胞體折光性增強(圖1C)。陽性對照組的細胞形態具有顯著的改善(圖1D)。

給予已損傷細胞不同濃度化合物3(1、2、5、10、20 μM)干預，CCK8 檢測其細胞存活率。結果顯示，Erastin(1 μM)損傷，化合物3(1、2、5、10、20 μM)干預24 h 后，細胞的存活率分別為9.84%、 34.65%、65.71%、73.40%和71.28%。陽性對照化合物Ferrostatin-1(0.1、0.2、0.5、1、2 μM)干預時細胞的存活率分別為5.45%、20.95%、48.96%、86.85%和102.06%。上述實驗結構顯示化合物3干預組隨濃度的升高(圖2)，可以逆轉Erastin損傷造成的HT22細胞存活率的濃度依賴性下降。

圖2 細胞存活率與化合物3濃度依賴關系Fig.2 Cell viability dependent on the concentration of compound 3注：A為陽性對照；B為化合物3。Note:A represents positive control;B represents compound 3.

化合物3在本實驗中顯示出較強的Erastin誘導的鐵死亡抑制活性，以Ferrostatin-1為陽性對照(IC50為0.35 μM)，其IC50為4.08 μM。其余化合物均沒有活性。

6 結論

本文總共從花椒中分離并鑒定了9個化合物，其中8個為異丁基酰胺類化合物。異丁基酰胺類化合物2～8首次接受了對HT22小鼠海馬神經元鐵死亡抑制活性測試。其中化合物3表現出較強的抑制活性，為異丁基酰胺類化合物的活性篩選提供了新方向，同時也為海馬神經元細胞鐵死亡抑制劑的篩選提供了新的植物源。此外，花椒提取物，尤其是花椒中的異丁基酰胺類化合物，可能在神經保護用藥開發中的具有良好前景。