越前水母共附生真菌Aspergillus fumigatus sp.次級代謝產(chǎn)物研究

李基興，楊 斌，劉永宏,3*，李云秋

1桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，桂林 541004；2中國科學(xué)院南海海洋研究所廣東省海洋藥物重點實驗室，廣州 510301；3南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣州 510275

海洋廣闊而獨特的水體環(huán)境，孕育出了豐富且代謝成分特殊的生物資源及微生物資源[1]。海洋微生物具有物種多樣性、遺傳多樣性、代謝產(chǎn)物化學(xué)多樣性等特點，海洋真菌是海洋微生物重要的組成部分，是新穎活性次級代謝產(chǎn)物的重要來源之一[2,3]。近年來，海洋微生物來源的化合物中已經(jīng)有13個被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市，有60余個臨床候選海洋藥物，這一數(shù)據(jù)說明海洋微生物次級代謝產(chǎn)物在治療人類疾病和新藥發(fā)現(xiàn)方面有著巨大的潛力[4]。據(jù)文獻報道，海洋真菌來源的聚酮、萜類、生物堿和肽類化合物等都有很好的生物活性[5]，其中肽類化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎等重要的生理活性，是創(chuàng)新藥物和藥物先導(dǎo)化合物的重要來源之一[6-10]。到目前為止，越前水母來源真菌研究甚少，更多的活性次級代謝產(chǎn)物還有待被挖掘，也說明真菌次級代謝產(chǎn)物在新藥研發(fā)領(lǐng)域還有較為廣闊的發(fā)展前景。

本課題組一直致力于海洋來源真菌活性次級代謝產(chǎn)物的研究[11-14]，本論文對來自于韓國南部海岸的越前水母中分離到的一株煙曲霉屬的菌株進行次級代謝產(chǎn)物的研究工作，從大米發(fā)酵產(chǎn)物中分離并鑒定了7個化合物，即sinulariapeptide C(1)、simplicilliumtide A(2)、simplicilliumtide B(3)、sinulariapeptide D(4)、4-羥基-17R-甲基降甾醇(5)、3-羥基苯乙酸甲酯(6)、鄰苯二甲酸二丁酯(7)。其中化合物1～4為肽類化合物，化合物1～7均為首次從越前水母來源的煙曲霉屬中分離得到。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

供試菌株分離自于2007年6月采集于韓國南部海岸的越前水母的組織中，將保藏于4 ℃的菌株接種到MB瓊脂固體平面培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中活化7天。然后接種到MB種子培養(yǎng)液(麥芽提取物1.5%，海鹽1.5%，水10 mL)中于28 ℃、180 rpm條件下?lián)u床活化3天，最后再接種至大米培養(yǎng)基(大米200 g，海鹽1.5%，水220 mL)中，室溫下靜置發(fā)酵45天，共發(fā)酵40瓶。

1.2 菌株鑒定

通過提取菌株的總DNA，并對DNA中的Intertek Testing Services(ITS)序列進行PCR擴增，及18S rRNA對比(18S rRNA基因序列由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測定)，將測出來的18S rRNA基因序列進行BLAST分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。鑒定為Aspergillusfumigatus，菌種保存于中國科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室。

1.3 主要儀器與試劑

主要儀器有：AV-700超導(dǎo)核磁共振儀(德國Bruker公司)、中壓制備色譜儀(Buchi公司)、Hitachi Primade高效液相色譜儀(日本日立公司)、ZYJ-S型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化株式會社，EYELAN-1100V-W型)等；主要試劑有：葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(Pharmacia公司)、薄層色譜及柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠)、分析純化學(xué)試劑(廣州化學(xué)試劑廠和天津富宇精細(xì)化工有限公司)等。

1.4 提取與分離

菌株發(fā)酵結(jié)束后將大米培養(yǎng)基搗碎，加入與搗碎物等體積的丙酮，超聲15 min。后用8層紗布減壓過濾，濾液經(jīng)減壓蒸餾至無有機溶劑，再用乙酸乙酯萃取3遍，減壓蒸干乙酸乙酯相得粗浸膏；殘渣用乙酸乙酯提取3遍至乙酸乙酯浸提液顏色接近無色，再經(jīng)濃縮得粗浸膏，合并二者得總浸膏共165 g。粗浸膏用100～200目的硅膠拌樣，經(jīng)中壓柱色譜(200～300目硅膠)分離(二氯甲烷/甲醇 100∶0～1∶1)梯度洗脫，再經(jīng)TLC檢識合并得7個流份。Fr.1經(jīng)ODS中壓反相柱色譜(MeOH/H2O 5∶95～∶0)分離得3個子流份，其中Fr.1-1再用半制備液相(CH3CN/H2O 6∶94)得到化合物6(1.8 mg)；Fr.2經(jīng)ODS中壓反相柱色譜(MeOH/H2O 5∶95～∶0)分離得9個子流份，其中Fr.2-9用半制備液相(CH3CN/H2O 67∶33)得到化合物5(15 mg)，F(xiàn)r.2-5用半制備液相(CH3CN/H2O 56∶44)得到化合7(6.4 mg)；Fr.7經(jīng)ODS中壓反相柱色譜(MeOH/H2O 5∶95～∶0)分離得8個子流份，其中Fr.7-6用半制備液相(CH3CN/H2O 28∶72)得到化合物1(2 mg)，F(xiàn)r.7-7用半制備液相(CH3CN/H2O 26∶74)得到化合物4(7.2 mg)，F(xiàn)r.7-8用半制備液相(CH3CN/H2O 31∶69)得到化合物2(3.5 mg)和化合物3(0.7 mg)?；衔锝Y(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 化合物1～7的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-7

2 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1和2的核磁數(shù)據(jù)(700和175 MHz，CD3OD，TMS，δ in ppm)

化合物1～3的核磁數(shù)據(jù)存在部分季碳缺失的情況，經(jīng)查閱文獻分析可能是由于氮原子的弛豫時間延長，使得氮原子附近部分碳信號消失。結(jié)合三者的核磁數(shù)據(jù)、質(zhì)譜等信息并與文獻[7,8]數(shù)據(jù)進行對照，因此確定了它們的結(jié)構(gòu)。

化合物4白色固體；化合物4的核磁數(shù)據(jù)與文獻[8]對照基本一致，故鑒定該化合物為sinulariapeptide D，具體核磁數(shù)據(jù)見表2。

表2 化合物3和4的核磁數(shù)據(jù)(700和175 MHz，CD3OD，TMS，δ ppm)

化合物5白色固體；1H NMR(CD3OD，700 MHz)δ：5.67(1H，d，J=0.7 Hz，H-2)，5.28(1H，dd，J=16.4，7.7 Hz，H-16)，5.22(1H，dd，J=16.4，8.4 Hz，H-15)，2.67(1H，dd，J=11.9，7.0 Hz，H-8)，2.23(1H，dt，J=14.0，3.5 Hz，H-5a)，2.09(1H，m，H-13)，1.98(1H，ddd，J=14.0，4.2，2.1 Hz，H-6a)，1.93(1H，m，H-10a)，1.87(1H，m，H-17)，1.81(1H，td，J=14.0，4.2 Hz，H-5b)，1.71(1H，m，H-9a)，1.61(1H，m，H-9b)，1.61(1H，m，H-6b)，1.52(1H，m，H-18)，1.50(1H，m，H-11)，1.48(1H，m，H-10b)，1.07(3H，d，J=7.0 Hz，H-14)，0.96(3H，d，J=7.0 Hz，H-21)，0.88(3H，d，J=7.0 Hz，H-20)，0.86(3H，d，J=7.0 Hz，H-19)，0.65(3H，s，H-12)；13C NMR(CD3OD，175 MHz)δ：173.6(C-1)，136.4(C-15)，133.8(C-16)，36.5(C-5)，36.2(C-6)，56.7(C-11)，51.7(C-8)，49.9(C-7)，44.3(C-17)，41.6(C-13)，34.4(C-18)，30.1(C-10)，22.3(C-9)，21.6(C-14)，20.5(C-20)，20.1(C-19)，18.2(C-21)，12.1(C-12)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻[15]對照基本一致，故鑒定該化合物為4-羥基-17R-甲基降甾醇。

化合物6淺黃色固體；1H NMR(CD3OD，700 MHz)δ：7.42(1H，d，J=7.7 Hz，H-4)，7.39(1H，m，H-2)，7.24(1H，t，J=8.4 Hz，H-5)，6.98(1H，dd，J=7.7，2.1 Hz，H-6)，3.86(3H，s，OCH3)，2.66(2H，s，H-7)；13C NMR(CD3OD，175 MHz)δ：168.8(C-8)，160.1(C-3)，132.4(C-1)，130.5(C-6)，121.8(C-5)，120.8(C-4)，117.5(C-2)，52.5(OCH3)，40.4(C-7)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻[17]對照后鑒定該化合物為3-羥基苯乙酸甲酯。

化合物7透明油狀物；1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ：7.71(2H，dd，J=5.6,，3.5 Hz,H- 3，6)，7.60(2H，dd，J=5.6，3.5 Hz，H-4，5)，4.29(4H，t，J=7.0 Hz,，H-2′，2″)，1.72(4H，m，H-3′，3″)，1.45(4H，m，H-4′，4″)，0.98(6H，t，J=7.0 Hz，H-5′，5″)，以上核磁數(shù)據(jù)與文獻[18]進行對照，鑒定該化合物為鄰苯二甲酸二丁酯。

3 討論與結(jié)論

本論文對分離自越前水母組織的真菌Aspergillusfumigatus的次級代謝產(chǎn)物進行了分離和鑒定，從中共獲得7個化合物，其中化合物1～7均為首次從越前水母來源的煙曲霉屬中分離得到。據(jù)文獻報道化合物1對五種植物病原真菌(薯蕷炭疽病菌、芒果炭疽病菌、橡膠炭疽病菌、水稻稻瘟菌及香蕉枯萎病菌)有較好的抑制活性[8]。化合物2對人白血病HL-60或K562細(xì)胞系有細(xì)胞毒性[7]?；衔?具有MptpB非競爭性抑制活性，其IC50值為35.0 μM[8]?；衔?對人體腫瘤細(xì)胞有很好的細(xì)胞毒性[15]。目前為止，對越前水母來源真菌的研究甚少，本論文豐富了越前水母來源真菌活性次級代謝產(chǎn)物的多樣性，也為后續(xù)藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和研究提供了參考。