Janus激酶3抑制劑對馬氏珠母貝珍珠囊發(fā)育和免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

谷澤豐，曹艷飛，楊海霞，焦 鈺

Janus激酶3抑制劑對馬氏珠母貝珍珠囊發(fā)育和免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

谷澤豐，曹艷飛，楊海霞，焦 鈺

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 2. 廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524025）

【】研究JAK3抑制劑對珍珠囊發(fā)育及移植免疫反應(yīng)的影響。以馬氏珠母貝（）為材料，植核前用JAK3抑制劑處理細(xì)胞小片和珠核，植核后18 d和30 d取珍珠囊，用石蠟切片技術(shù)和H.E.染色法（Hematoxylin-eosin Staining）觀察JAK3抑制劑對珍珠囊發(fā)育的影響，利用熒光定量技術(shù)檢測植核后不同時間（6、12、24 h和3、6、12、18、30 d）免疫相關(guān)基因NF-kappaB（Nuclear factor kappa B）、IkappaK（I-kappaB kinase）和炎性誘導(dǎo)因子IL-17（Interleukin 17）的表達(dá)變化。植核后18 d和30 d，與對照組相比，JAK3抑制劑對珍珠囊的發(fā)育沒有顯著影響(> 0.05)。熒光定量結(jié)果顯示，植核后6 h和12 h，JAK3抑制劑可以顯著性抑制IL-17的表達(dá)，植核后6、3、6、12 d，JAK3抑制劑可以顯著性抑制NF-kappaB的表達(dá)，植核后3、6 d，JAK3抑制劑可以顯著性抑制IkappaK的表達(dá)(< 0.05)。JAK3抑制劑對馬氏珠母貝免疫基因表達(dá)有明顯的抑制作用，可以有效調(diào)控珍珠貝植核后的移植免疫，而對珍珠囊發(fā)育的影響不明顯。

馬氏珠母貝；珍珠囊；移植免疫；Janus激酶3抑制劑

目前，海水珍珠養(yǎng)殖所用的主要珍珠貝是馬氏珠母貝，又稱為合浦珠母貝，其所產(chǎn)珍珠總量占全國總產(chǎn)量95%以上[1-2]。在人工珍珠養(yǎng)殖過程中，需要向育珠貝中植入1個供體貝的外套膜細(xì)胞小片組織和1個圓形的珠核[3]，由于植入細(xì)胞小片與珠核為外來物，育珠貝在接受植核手術(shù)后會發(fā)生移植免疫，并引發(fā)一系列的免疫應(yīng)答。有效的免疫應(yīng)答可以幫助貝體及時清除抗原性異物，保護(hù)機(jī)體不受到侵害[4]，但過強(qiáng)的免疫反應(yīng)會導(dǎo)致貝體吐核甚至是死亡，嚴(yán)重影響珍珠的質(zhì)量和產(chǎn)量。因此，植核誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)會對珍珠的形成發(fā)揮關(guān)鍵作用，它的程度將會直接影響珍珠的質(zhì)量和產(chǎn)量。

JAK（Janus kinase）蛋白家族參與組成了動物體重要的免疫信號傳導(dǎo)途徑—JAK-STAT（Signal transducer and activator of transcription）通路，對機(jī)體的免疫應(yīng)答具有重要調(diào)控作用[5]，這個信號通路的發(fā)現(xiàn)讓研究人員對細(xì)胞因子作用和基因調(diào)控有更為深入的認(rèn)知[6]。目前，已發(fā)現(xiàn)JAK蛋白家族主要分為4個亞型：JAK1、JAK2、JAK3、TyK2。其中，JAK3可以被多種細(xì)胞因子激活，賦予細(xì)胞多種生理功能，且能夠激活基因，引發(fā)一系列免疫相關(guān)基因的連鎖表達(dá)[7]。而JAK3抑制劑作為本世紀(jì)發(fā)明應(yīng)用的新型免疫疾病治療藥物[8]，可以有效抑制和調(diào)節(jié)JAK3蛋白，并且抑制由細(xì)胞信號因子和細(xì)胞因子共同作用而引發(fā)的基因表達(dá)，從而達(dá)到抑制移植免疫反應(yīng)的作用[9]。

本研究以養(yǎng)殖的馬氏珠母貝為實驗材料，利用石蠟切片技術(shù)（Paraffin Section Technology）、H.E.染色法（Hematoxylin-eosin Staining）以及熒光定量法分析JAK3抑制劑對馬氏珠母貝植核育珠后珍珠囊的發(fā)育，以及免疫相關(guān)基因的表達(dá)情況，為有效調(diào)控珍珠貝移植排斥反應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗貝材料

馬氏珠母貝取自廣東省湛江市徐聞養(yǎng)殖基地，規(guī)格統(tǒng)一且貝齡為2 齡，利用人工插核技術(shù)進(jìn)行植核后珍珠貝培育工作。植核實驗分為2組：一組是正常植核過程的馬氏珠母貝，為對照組；另一組是實驗組，首先利用JAK3抑制劑處理細(xì)胞小片和珠核，然后將處理過的細(xì)胞小片和珠核植入馬氏珠母貝。

1.2 珍珠囊組織切片的制備

分別在植核手術(shù)后18 d和30 d，對照組與JAK3抑制劑處理組各取插核貝5只，分別分離珍珠囊組織，用苦味酸進(jìn)行預(yù)固定，再在青霉素小瓶中將材料繼續(xù)固定一夜。將固定好的材料用不同濃度梯度的乙醇溶液逐步脫水洗滌，再用二甲苯溶液將材料透明。將脫水透明后的材料浸蠟并進(jìn)行包埋，再將包埋后的大蠟塊進(jìn)行切割修整并用切片機(jī)進(jìn)行切片貼片。將切片用二甲苯溶液、二甲苯與乙醇混合溶液以及不同濃度梯度的乙醇溶液進(jìn)行脫蠟復(fù)水并用蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-eosin Staining）對玻片進(jìn)行染色。用中性樹膠對切片封藏，通過Leica MD6000B型生物顯微鏡觀察制作好的珍珠囊組織切片，再通過Laica DFC500數(shù)碼顯微鏡拍照系統(tǒng)進(jìn)行觀察、拍照記錄。

1.3 熒光定量PCR的測定

用于實時熒光定量PCR檢測的材料取自馬氏珠母貝的血細(xì)胞。分別在植核手術(shù)后6、12、24 h和3、6、12、18、30 d抽取并離心分離，得到血細(xì)胞，再使用Trizol 法進(jìn)行提取總RNA。模板cDNA的獲得參照Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）說明書進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄合成得到植核后馬氏珠母貝各個時間的cDNA。

將上述反轉(zhuǎn)得到cDNA產(chǎn)物作為模板，以β-actin為熒光定量內(nèi)參基因進(jìn)行實時熒光定量PCR。運用2-△△CT[10]法分析計算血細(xì)胞相對表達(dá)量，運用SPSS 22.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan’s多重比較對均值進(jìn)行差異顯著性檢驗，顯著性水平= 0.05。

表1 熒光定量PCR所用引物序列

qRT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 JAK3抑制劑對馬氏珠母貝珍珠囊的影響

植核后18 d和30 d，對照組與JAK3抑制劑處理組各取10只插核貝，分離珍珠囊組織，統(tǒng)計珠囊成囊率。在植核后18 d，對照組和JAK3抑制劑處理組的馬氏珠母貝珍珠囊的成囊率均為80%，在植核后30 d，對照組和JAK3抑制劑處理組的馬氏珠母貝珍珠囊的成囊率均為100%結(jié)果說明，JAK3抑制劑對馬氏珠母貝珍珠囊成囊率沒有影響。

有研究表明，在珍珠囊發(fā)育過程中，其表皮細(xì)胞形態(tài)會經(jīng)歷一個由扁平-柱狀-扁平的形態(tài)轉(zhuǎn)變過程[17]。在植核后30 d，一般處于前期的扁形，或者柱形細(xì)胞。珍珠囊表皮細(xì)胞形態(tài)變化觀察結(jié)果見圖1。

A：對照組18 d珍珠囊，表皮細(xì)胞為扁平細(xì)胞；B：JAK3抑制劑處理組18 d珍珠囊，表皮細(xì)胞由扁平細(xì)胞向柱狀細(xì)胞過度；C：JAK3抑制劑處理組18天珍珠囊，表皮細(xì)胞為柱狀細(xì)胞；D：對照組30 d珍珠囊，表皮細(xì)胞為柱狀細(xì)胞; : 扁平細(xì)胞； : 柱狀細(xì)胞。

植核后18 d，對照組樣本中4個囊內(nèi)表皮細(xì)胞為扁平細(xì)胞，1個為柱狀細(xì)胞；JAK3抑制劑處理組2個囊內(nèi)表皮細(xì)胞為扁平細(xì)胞，3個為柱狀細(xì)胞。植核后30 d，對照組樣本中3個囊內(nèi)表皮細(xì)胞為扁平細(xì)胞，2個為柱狀細(xì)胞；JAK3抑制劑處理組中2個囊內(nèi)表皮細(xì)胞為扁平細(xì)胞，3個為柱狀細(xì)胞（圖1）。這些數(shù)據(jù)說明JAK3抑制劑可能對馬氏珠母貝珍珠囊表皮細(xì)胞組織形態(tài)變化有少量的促進(jìn)作用，但仍需大量樣本的驗證。

2.2 JAK3抑制劑對馬氏珠母貝免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

熒光定量結(jié)果顯示，與對照組相比，在植核后6 h，12 h，JAK3抑制劑可以顯著性抑制炎性因子IL-17的表達(dá)；在植核后6 h，3 d，6 d和12 d，JAK3抑制劑可以顯著性抑制NF-kappaB的表達(dá)；在植核后3 d和6 d，JAK3抑制劑可以顯著性抑制IkappaK的表達(dá)。這些結(jié)果表明，JAK3抑制劑對馬氏珠母貝免疫基因表達(dá)有著明顯的抑制作用（圖2）。

柱子上不相同小寫字母表示基因表達(dá)在JAK3抑制劑處理組和對照組間有顯著性差異（< 0.05）

The different lowercase letters on the adjacent columns indicated that the gene expression have significant difference between JAK3 inhibitor treated group and the control goup (< 0.05)

圖2 JAK3抑制劑對免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

Fig. 2 The relative expression of genes at different time in the two groups

3 討論

Janus激酶是一種細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶，普遍存在于哺乳動物細(xì)胞胞質(zhì)中，目前已發(fā)現(xiàn)JAK1、JAK2、JAK3和TyK2等4個亞型[7]。其中JAK1、JAK2和TyK2亞型在動物體組織細(xì)胞中均有分布，而JAK3則特異性地分布在動物體的骨髓和淋巴細(xì)胞中，并在活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞中高度表達(dá)，所以JAK3抑制劑不僅能有效抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)，還沒有毒副作用[11]。黃堃[12]研究表明，JAK蛋白家族在參與哺乳動物細(xì)胞免疫中可以作為干擾素受體或細(xì)胞因子受體的效應(yīng)分子向細(xì)胞內(nèi)傳達(dá)免疫信號，JAK催化受體上的酪氨酸受體與周圍的氨基酸序列產(chǎn)生“停泊位點”，然后招募STAT蛋白到這個“停泊位點”與之形成JAK-STAT通路，STAT蛋白形成二聚體入核，結(jié)合DNA調(diào)控分子轉(zhuǎn)錄，激活基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。JAK3抑制劑可以有效抑制JAK-STAT通路形成，抑制細(xì)胞因子表達(dá)，從而抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)。貝類的免疫作用是一種非特異性的低等免疫反應(yīng)，可以分為細(xì)胞免疫與體液免疫等2種方式。袁萬安等[13]研究表明，育珠蚌在植核后由于受到植入細(xì)胞小片和珠核所需手術(shù)的損傷，以及植核中因操作不當(dāng)而造成的外物侵入，這一系列外界刺激會激活育珠蚌的免疫系統(tǒng)，促使蚌內(nèi)的多能干細(xì)胞活化并增殖，分化形成3種免疫細(xì)胞：巨嗜細(xì)胞、嗜堿性顆粒細(xì)胞和嗜酸性顆粒細(xì)胞，3種免疫細(xì)胞再會通過吞噬作用和炎癥反應(yīng)等來達(dá)到免疫的目的。劉世良等[14]認(rèn)為貝類中的體液免疫是由血細(xì)胞分泌大量的體液因子到血漿中發(fā)揮防御作用，所以在貝類中，細(xì)胞免疫與體液免疫是密不可分的。而在貝類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有類白細(xì)胞介素IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-6、TNF-a等細(xì)胞因子的存在，并且具備有高等動物中的類似功能。本課題組之前發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝中存在炎性因子IL-17，參與調(diào)控貝類免疫反應(yīng)。

Huang等[15]發(fā)現(xiàn)珍珠貝IL-17可以活化靶基因中NF-kappaB的結(jié)合位點，參與并激活NF-kappaB信號通路的產(chǎn)生。而NF-kappaB是由Sen等[16]首次發(fā)現(xiàn)的，他們是在B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種能與免疫球蛋白kappa輕鏈基因增強(qiáng)子B位點特異結(jié)合的核蛋白因子，他們稱之為核因子kappaB。NF-kappaB是一種在真核生物中比較保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，它幾乎在所有細(xì)胞和組織中都有表達(dá)，并由這一類家族成員形成的同源或異源二聚體，結(jié)合在含有NF-kappaB結(jié)合位點的基因啟動子或增強(qiáng)子上，形成NF-kappaB信號通路。NF-kappaB信號通路能夠快速調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織、器官和有機(jī)體正常生理活動與生命周期的作用。所以，當(dāng)NF-kappaB信號通路被抑制時，炎癥因子的表達(dá)以及機(jī)體的免疫反應(yīng)就能得到很好控制，從而有效控制移植免疫，提高移植成功率。NF-kappaB信號通路中有1個至關(guān)重要的中樞分子就是IkappaK復(fù)合物，它在整個NF-kappaB形成過程中起重要承接作用。當(dāng)外界傳達(dá)來刺激時，活化信號會先傳送到IkappaK復(fù)合物，隨后被活化的IkappaK復(fù)合物再去激活NF-kappaB，從而完成整個信號通路過程[17]。所以NF-kappaB、IkappaK和IL-17之間具有密切聯(lián)系，共同協(xié)作激活機(jī)體免疫反應(yīng)，三者的表達(dá)情況共同反應(yīng)出機(jī)體免疫反應(yīng)的情況。我們課題組前期研究[18]表明，植核手術(shù)可以誘導(dǎo)IL-17、NF-kappaB和IkappaK的表達(dá)，說明植核手術(shù)誘導(dǎo)了珍珠貝的免疫反應(yīng)，但JAK3抑制劑可以顯著性抑制植核手術(shù)誘導(dǎo)的IL-17、NF-kappaB和IkappaK的表達(dá)，說明JAK3抑制劑可以有效調(diào)控珍珠貝植核后的移植免疫。

通過對珍珠囊形成率和顯微結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，JAK3抑制劑對珍珠囊的形成率沒有顯著影響，但對珍珠囊表皮細(xì)胞的形態(tài)轉(zhuǎn)變具有一定促進(jìn)作用。已有研究表明，珍珠囊表皮細(xì)胞是由植入的細(xì)胞小片外表皮細(xì)胞逐漸遷移到珠核周圍再經(jīng)過增殖形成的，在不同時期的細(xì)胞形態(tài)也有所不同。在植核后15 ~ 20 d時先形成扁平狀細(xì)胞，在植核后20 ~ 30 d時由扁平狀向高柱狀細(xì)胞轉(zhuǎn)變，在插核后 60 d時柱狀細(xì)胞又轉(zhuǎn)變成扁平狀細(xì)胞并具有穩(wěn)定分泌功能。早期的扁平狀細(xì)胞沒有分泌功能，而柱狀細(xì)胞分泌物對棱柱層和殼皮層的形成具有重要作用，在后期的扁平細(xì)胞時才能分泌珍珠質(zhì)，形成珍珠層[19]。JAK3抑制劑對珍珠囊表皮細(xì)胞由早期扁平細(xì)胞向柱狀細(xì)胞轉(zhuǎn)變具有一定促進(jìn)作用，這可能會促進(jìn)珍珠質(zhì)形成，增加珍珠質(zhì)量。

綜上，JAK3抑制劑對馬氏珠母貝免疫基因表達(dá)有著明顯抑制作用，而對珍珠囊發(fā)育的影響不明顯。因此，JAK3抑制劑可以有效調(diào)控珍珠貝的移植免疫，可以應(yīng)用于珍珠生產(chǎn)。

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Effect of Janus Kinase 3 Inhibitor on the Development of Pearl Sac and the Expression of Immune-related Genes in Pearl Oyster

GU Ze-feng, CAO Yan-fei, YANG Hai-xia, JIAO Yu

（1.// 2.,524088,）

Excessive immune response in pearl oyster after nucleus-grafting surgery could affect the development of pearl sac, leading to a decline in the quality and quantity of pearls. Our previous research showed that Janus kinase 3 inhibitor (JAK3 inhibitor) could reduce the mortality after nucleus-grafting surgery. In this research, we detectedthe effect of JAK3 inhibitors on pearl sac development and immune response after grafting.We pre-treated the mantle piece and pearl nuclei with JAK3 inhibitors before grafting surgery in pearl oyster, and observed the development of pearl sac formation through paraffin section technology and H.E standing, and detected the immune related genes by fluorescence quantitative detection technology (qRT-PCR) after grafting.JAK3 inhibitors have no significant effect on the development of pearl sacs compared with the control group at 18 d and 30 d after the grafting. The result of qRT-PCR showed that JAK3 inhibitors could significantly down-regulated NF-kappaB expression at 6 h, 3 d, 6 d and 12 d after grafting, and reduced the expression of IkappaK at 3 d and 6 d, and inhibited the proinflammatory cytokine IL-17 expression at 6 h and 12 h.JAK3 inhibitor treatment can effectively inhibit immune response after grafting in pearl oyster.

; pearl sac; transplantation immunology;inhibitor of Janus kinase3

S917.4

A

1673-9159（2020）02-0001-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.001

2019-10-23

國家自然科學(xué)基金（31672626）

谷澤豐（1997－）, 男，碩士研究生，研究方向為珍珠培育與加工。Email:83623566@qq.com

焦鈺（1981－）, 女, 博士, 教授。E-mail: Gaoyang@126.com

谷澤豐，曹艷飛，楊海霞，等. Janus激酶3抑制劑對馬氏珠母貝珍珠囊發(fā)育和免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2020，40（2）：1-6.

（責(zé)任編輯：劉嶺）