二十二碳五烯酸對淋巴細胞活性及單胺類神經遞質的影響

李舒蕊，張 才，張理強，殷靜雯，顏海鋒，張永平，趙 帥，宋 采,4

二十二碳五烯酸對淋巴細胞活性及單胺類神經遞質的影響

李舒蕊1，張 才1，張理強2，殷靜雯3，顏海鋒3，張永平1，趙 帥1，宋 采1,4

（1. 廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2. 湛江市第三人民醫院，廣東 湛江 524012；3. 廣東醫科大學附屬醫院，廣東 湛江 524023；4. 廣東海洋大學深圳研究院，廣東 深圳 518120；）

【】研究二十二碳五烯酸（Docosapentaenoic acid，DPA）對精神分裂癥患者外周血淋巴細胞的活性及細胞內單胺類神經遞質的調節作用。將正常人和病人的外周血淋巴細胞分為對照組、病人組、對照+DPA組（0~200 μmol/L）、病人+DPA組（150 μmol/L），用DPA處理細胞48 h。用CCK8法檢測細胞存活率，用高效液相色譜法檢測血漿中多巴胺及其代謝物的含量，檢測淋巴細胞中去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺和代謝物的含量。與對照組相比，精神分裂癥患者外周血淋巴細胞存活率下降，血漿中的多巴胺（DA）及其代謝產物二羥苯乙酸（DOPAC）含量上升，淋巴細胞中的多巴胺與其代謝產物、5-羥色胺（5-HT）與其代謝物5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）的含量顯著下降，DA/DOPAC、5-HT/5-HIAA比值顯著升高，去甲腎上腺素代謝物的含量顯著下降。DPA可以顯著提高淋巴細胞的存活率，提高多巴胺、5-羥色胺及其代謝物的含量，降低DA/DOPAC、5-HT/5-HIAA比值，提高去甲腎上腺素代謝物的含量。DPA可以提高精神分裂癥患者外周血淋巴細胞的存活率，調節單胺類神經遞質的含量。

二十二碳五烯酸（DPA）；精神分裂癥；淋巴細胞；神經遞質

精神分裂癥是一種發病原因尚未明確的重度精神疾病，在臨床表現上會極大的影響患者的感知覺、思維、情感、意志和行為、認知功能[1]。精神分裂癥病因十分復雜，目前應用最廣泛的是神經遞質假說，該假說認為引起精神分裂癥的原因是患者體內的神經遞質比例失衡，特別是多巴胺和5-羥色胺（5-HT）的異常[2-3]。近年來，免疫炎癥假說作為病因學，已經提出免疫炎癥對單胺類神經遞質的代謝、神經內分泌功能的影響是介導炎癥與精神分裂癥之間聯系的潛在途徑[4]。淋巴細胞是免疫炎癥中重要的調控細胞[5-8]，外周淋巴細胞可通過腦膜淋巴管與外周免疫系統進入中樞[9-10]，其細胞膜表面能夠表達多種神經遞質的受體[11]，不僅可介導免疫細胞間的聯系，還能參與免疫系統與神經系統之間的雙向溝通[12-15]。臨床上，典型或非典型的抗精神分裂癥藥物多是5-羥色胺受體5HTR1A的激動劑，或是5-羥色胺受體5HTR2A和多巴胺受體的拮抗劑[16]，僅能針對部分陽性癥狀[17-18]，副作用極大，在治療精神分裂的同時也帶給患者巨大的機體傷害。因此，從天然產物中開發一種藥效高、副作用小的藥物有重要意義。

二十二碳五烯酸（Docosapentaenoic acid，DPA）是人腦組織、神經細胞的主要組成成分，主要存在于海洋哺乳動物的脂質中，在海豹和鯨魚中的含量較豐富，具有抗炎的作用[19-20]，可以促進和提高人體的免疫能力，修復損傷細胞膜磷脂和單胺類神經遞質的膜受體，影響單胺類遞質系統的功能并改變它們的儲存和釋放。二十碳五烯酸（Eicosapentae-noic Acid，EPA）在臨床上已被證實可以預防和治療精神分裂癥[21-22]，筆者團隊與其他科研人員發現，外源性的EPA在體內代謝生成大量的中間產物DPA，但終產物DHA的含量卻沒有上升，因此提出設想，EPA在體內是否是通過增加DPA而非DHA的含量起調控作用。在此前的一些研究中，DPA顯示了比EPA更好的抗炎與提高免疫的作用，但在改善精神分裂癥方面尚未見報道。

本研究采用精神分裂癥患者血中淋巴細胞作為模型，通過檢測淋巴細胞的存活率、血漿和細胞內單胺類神經遞質含量的變化，研究DPA對精神分裂癥患者血中淋巴細胞的影響，以期為海洋天然產物DPA的保健產品開發提供相關數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人外周靜脈血，廣東省湛江市第三人民醫院采集；人外周血單核細胞分離液（批號：TBD2011H），天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；RPMI 1640培養基（批號：C11875500BT）、胎牛血清（批號：A3160802）、雙抗（批號：15140-122），美國gibco公司；DPA（批號：0537605-13），Cayman chemical公司；CCK8（批號：CK04），日本東仁化學科技有限公司；神經遞質標準品，美國sigma公司。

1.2 儀器與設備

酶標儀，biotek公司；高效液相色譜，美國安捷倫公司；倒置顯微鏡，Olympus公司；二氧化碳培養箱，Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞的處理與培養 病人與對照組在約上午6:00空腹狀態下用EDTA抗凝的真空采血管采集靜脈血。在4 ℃條件下，1 800 r/min離心10 min，取出血漿，并用相同體積的1640培養基加入到剩余的血細胞中，于50 mL離心管中按比例緩慢加入兩倍血細胞體積的分離液（分離液1與分離液2的比例為3∶1），在分離液的上方緩慢加入稀釋后的血細胞。以500 r/min離心30 min，取上層白色環狀的淋巴細胞于15 mL的離心管中，加入1640培養基清洗細胞，在4℃條件下，以400 r/min轉速離心10 min。棄去上清，重復清洗細胞一次。用細胞計數儀記錄細胞數目并且收集細胞存活率達到95%以上的淋巴細胞用于下一步培養。

1.3.2 CCK8法檢測DPA毒性 將得到的正常人淋巴細胞制成濃度為2×106mL-1的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設置5個復孔。按照實驗分為對照組（正常人的淋巴細胞）、DPA藥物處理組（DPA濃度為10、20、30、40、50、100、150、200 μmol/L）。接種細胞后將96孔板放置在培養箱中平衡3 h，培養箱參數37℃，二氧化碳體積分數5%，待細胞狀態穩定，按照分組加入不同濃度的DPA，繼續培養48 h后檢測DPA對細胞的毒性。檢測時每孔加入體積分數為10%的CCK8試劑反應4 h，在波長450 nm下測定各孔的光密度，并計算細胞活性。

1.3.3 DPA濃度的確定 將得到的病人與正常人的淋巴細胞制成細胞濃度為2×106mL-1的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設置5個復孔。正常人的淋巴細胞設置為對照組，精神分裂癥患者的淋巴細胞設置為藥物處理組（DPA濃度為10、20、30、40、50、100、150、200 μmol/L）和未處理組。接種細胞后將96孔板放置在培養箱中平衡3 h，培養箱參數37℃，二氧化碳濃度5%，待細胞狀態穩定，按照分組不加入或加入不同濃度的DPA，繼續培養48 h后檢測細胞活性。每孔加入體積分數為10%的CCK8試劑反應4 h，在450 nm的波長下測定各孔的光密度，并計算細胞活性。取細胞活性最高的濃度作為藥物處理濃度。

1.3.4 外周血血漿與淋巴細胞中單胺類神經遞質的檢測 配置組織裂解液：稱取乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）0.018 61 g（稱量誤差控制在1%以內），加入50 mL超純水后再緩慢加入5 mL高氯酸，最后用超純水定容至100 mL。配置高氯酸沉淀劑：稱取磷酸氫二鉀27.386 4 g和EDTA-Na20.074 4 g（稱量誤差控制在1%以內）用超純水溶解并定容至100 mL。收集分離出的血漿200 μL和淋巴細胞2×106個于1.5 mL離心管中，加入組織裂解液100 μL，充分吹打混勻，使細胞破裂釋放出神經遞質，冰上放置10 min充分裂解。在4℃的條件下，14 000 r/min離心15 min，吸取上清液于1.5 mL的離心管中，按照體積分數比1∶1加入高氯酸沉淀劑，混勻后冰浴10 min。4℃條件下，14 000 r/min離心15 min，用1 mL注射器小心吸取上清。將上清用0.45 μmol/L的水系濾膜過濾至液相專用小瓶中，待用。配置水系流動相：稱取檸檬酸10.507 g，無水乙酸鈉4.1015 g，庚烷磺酸鈉0. 101 125 g和EDTA-Na20.186 12 g，溶解在1 L的超純水中，再加入三乙胺0.69 mL。水系流動相用0.45 μmol/L的水系濾膜抽濾，甲醇使用0.22 μmol/L的有機膜抽濾，最后兩種流動相均在超聲清洗儀中脫氣5 min除去氣泡。色譜柱選用C18柱，流動相由檸檬酸-乙酸鈉緩沖溶液、甲醇混合而成（兩者體積比為87∶13），流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL，FLD檢測器，檢測波長為：發射波長330 nm和激發波長280 nm。

1.3.5 數據處理 數據處理使用GraphPad Prism 7進行統計分析。細胞部分數據用均值±標準誤（±SEM）表示，其余數據用均值±標準差（±SD）表示。數據采用-test分析，< 0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 DPA對正常人和精神分裂癥患者外周血淋巴細胞存活率的影響

為測定DPA對淋巴細胞的作用，首先評價其對正常淋巴細胞活性的影響。圖1可見，所有濃度（10、20、30、40、50、100、150、200 μmol/L）的DPA對正常人外周血淋巴細胞均未產生毒性（＞0.05）。

精神分裂癥患者的淋巴細胞活性低于正常人的淋巴細胞（＜0.001），說明病人的淋巴細胞受到了一定程度的損傷。不同濃度的DPA（10、20、30、40、50、100、150、200 μmol/L）均能提高細胞存活率（＜0.05），在DPA濃度達到150 μmol/L時，細胞存活率不再增加，并與未經DPA處理的病人組達到非常顯著（＜0.001），因此選用150 μmol/L作為藥物處理的濃度，進行后續的實驗研究。

2.2 精神分裂癥患者外周血血漿中多巴胺及其代謝物含量的變化

圖2A、2B中，精神分裂癥患者血漿中的多巴胺（DA）及其代謝產物二羥苯乙酸（DOPAC）含量顯著升高（＜0.05），而在患者體內過多的多巴胺會引起神經元的持續興奮，引發病變。圖2C、2D中，DA/DOPAC比值升高（＜0.05），說明多巴胺代謝異常，DA/5-HT比值升高（＜0.001），表明精神分裂癥患者體內神經遞質失衡。

CT，對照組；SZ，病人組；* P<0.05，*** P＜0.001 vs. CT組

2.3 精神分裂癥患者外周血淋巴細胞內單胺類神經遞質含量的變化

如圖3所示，與正常組相比，精神分裂癥患者外周血淋巴細胞中的去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）含量無顯著變化，代謝物3-甲基-4-羥基苯乙二醇（3-methoxy-4-hydroxy- phenylglycol，MHPG）含量顯著下降（＜0.01），NE/MHPG比值顯著上升（＜0.05），說明在精神分裂癥患者外周血淋巴細胞中，去甲腎上腺素的代謝被抑制。

CT，對照組；SZ，病人組；*P<0.05，**P<0.01 vs. CT組；#P<0.05，##P<0.01 vs. SZ組

如圖4A與5A所示，多巴胺（DA）（＜0.01）和5-羥色胺（5-HT）（＜0.001）的含量顯著下降，同時圖4B與5B也顯示它們的代謝產物二羥苯乙酸（DOPAC）（＜0.05）和5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）（＜0.0001）的含量顯著下降。從圖4C、5C與5D中可看出，DA（＜0.05）和5-HT（＜0.01）與他們代謝物的比值均顯著上升，DA與5-HT的比值顯著升高（<0.0001）。DA與5-HT是興奮性神經遞質，他們的代謝異常、相互之間的比例失衡，被視作精神分裂癥發病的重要原因之一，上述結果再次證明了此假說。經DPA處理后，可以顯著增加細胞內單胺類神經遞質的含量（＜0.01），并且降低NE/MHPG（＜0.05）、DA/DOPAC（＜0.05）、5-HT/5-HIAA（＜0.01）、DA/5-HT（<0.0001）的比值，使得精神分裂癥患者外周血淋巴細胞內的單胺類神經遞質代謝趨于正常。

CT，對照組；SZ，病人組；*P<0.05，**P<0.01 vs. CT組；#P<0.05，##P<0.01 vs. SZ組

**P<0.01，***P＜0.001，****P<0.0001 vs. CT組；##P<0.01，####P<0.0001 vs. SZ組

3 討論

本實驗顯示，病人外周淋巴細胞內的神經遞質5-HT和它的代謝產物5-HIAA的含量均顯著降低，說明在精神分裂癥患者中5-HT能系統功能低下和其代謝發生紊亂，結果與精神分裂癥的5-HT假說一致[23]。在血漿與淋巴細胞中多巴胺和它的代謝產物比值顯著升高，與多巴胺-動機突顯學說一致。同時也發現DA/5-HT的比值顯著升高，與DA能系統和5-HT能系統失衡假說一致[24]。結果還顯示，精神分裂癥病人血漿中NE和它的代謝產物MHPG的比值上升，說明精神分裂癥患者中NE能系統功能降低和其代謝發生紊亂，結果與精神分裂癥的NE假說一致[25]。在淋巴細胞中加入DPA培養48 h后，再檢測淋巴細胞中的神經遞質含量，發現上述結果均得到顯著逆轉。

在淋巴細胞通過免疫炎癥系統調控精神分裂癥的同時，自身也受到精神分裂癥患者體內異常神經遞質的影響而改變功能。淋巴細胞釋放的促炎因子對多巴胺和去甲腎上腺素的合成和釋放有調控作用[11]，而去甲腎上腺素的升高會對T淋巴細胞的增殖產生抑制作用[26]。淋巴細胞產生的促炎因子、免疫相關基因和精神分裂癥水平升高以及與疾病相關的腦部改變之間存在聯系[10]。DPA提高淋巴細胞的活性可以改善淋巴細胞的異常狀態，而調節單胺類神經遞質的含量，則在一定程度上具有與抗精神分裂藥物相似作用。

4 結論

DPA可以提高精神分裂癥外周淋巴細胞的存活率，并對細胞內神經遞質含量具有影響，為精神分裂癥的海洋藥物研發提供了可能性，但其調控作用更深層的分子水平機制仍有待研究。

[1] KRAEPELIN A, KRAEPELIN P. Negative symptoms in schizophrenia[J]. Industrial Psychiatry Journal, 2016, 25(2): 135-144.

[2] OLIVER H, ROB M C, JAMES S. Glutamate and dopamine in schizophrenia: an update for the 21st century[J]. Journal of Psychopharmacology, 2015, 29(2): 97.

[3] TOST H, ALAM T, MEYER-LINDENBERG A. Dopa- mine and psychosis: Theory, pathomechanisms and intermediate phenotypes[J]. Neuroscience & Biobehavioral Reviews, 2010, 34(5): 689-700.

[4] HAROON E, RAISON C L, MILLER A H. Psychoneu- roimmunology meets neuropsychopharmacology: translational implications of the impact of inflammation on behavior[J]. Neuropsychopharmacology : official publication of the American College of Neuropsychopharmacology, 2012, 37(1): 137-162.

[5] CHASE K A, CONE J J, ROSEN C, et al. The value of interleukin 6 as a peripheral diagnostic marker in schizophrenia[J]. Bmc Psychiatry, 2016, 16(1): 1-7.

[6] AL-DIWANI A A, POLLAK T A, IRANI S R, et al. Psychosis: an autoimmune disease?[J]. Immunology, 2017, 152(3): 153.

[7]FINEBERG A M, ELLMAN L M. Inflammatory cytokines and neurological and neurocognitive alterations in the course of schizophrenia[J]. Biological Psychiatry, 2013, 73(10): 951-966.

[8] MEYER U. The Wiley-Blackwell Handbook of Psycho- neuroimmunology[M]. United States of America：John Wiley & Sons Ltd, 2013: 411-424.

[9] MALE D, PYRCE G, HUGHES C, et al, Lymphocyte migration into brain modelled in vitro: control by lymphocyte activation, cytokines, and antigen[J]. Cellular Immunology, 1990, 127(1): 1-11.

[10] BRADSTREET J J, RUGGIERO M, PACINI S. Commentary: Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels[J]. Frontiers in Neuroscience, 2015, 9(934): 337-341.

[11] PERL O, STROUS R D, DRANIKOV A, et al. Low levels of α7-nicotinic acetylcholine receptor mrna on peripheral blood lymphocytes in schizophrenia and its association with illness severity[J]. Neuropsychobiology, 2006, 53(2): 88-93.

[12] 黃麗娟, 王衛東. 帕金森病相關外周血淋巴細胞生物標志物的研究進展[J]. 中國老年學, 2016, 36(21): 5484-5487.

[13] KHANDAKER G M, COUSINS L, DEAKIN J, et al. Inflammation and immunity in schizophrenia: implications for pathophysiology and treatment[J]. Lancet Psychiatry, 2015, 2(3): 258-270.

[14] 張向陽, 周東豐, 郭華. 抑郁癥、精神分裂癥患者細胞免疫和血超氧化物歧化酶的對照研究[J]. 中華精神科雜志, 2000, 33(1): 26-28.

[15] 張向陽, 周東豐, 張培琰, 等. 慢性精神分裂癥病人的免疫功能測定[J]. 中華精神科雜志, 1996, 29(4): 205-208.

[16] MELTZER H Y, SUMIYOSHI T. Does stimulation of 5-HT1A receptors improve cognition in schizophrenia?[J]. Behavioural Brain Research, 2008, 195(1):0-102.

[17] CHENG P C, ZHONG Y G, FENG R, et al. Clinical features of patients with treatment-resistant schizophrenia[J]. Chinese Mental Health Journal, 2012, 26(8): 566-570.

[18] 張馨月, 姚晶晶, 呂一丁, 等. 精神分裂癥的發病機制及治療靶點的研究進展[J]. 國際精神病學雜志, 2018, 45(2): 201-204.

[19] MORIN C, BLIER P U, FORTIN S. Eicosapentaenoic acid and docosapentaenoic acid monoglycerides are more potent than docosahexaenoic acid monoglyceride to resolve inflammation in a rheumatoid arthritis model[J]. Arthritis Research & Therapy, 2015, 17(1): 142. ZHANG Yiran , MIN Junxia , ZHANG Lijuan

[20] ZHANG Y R, MIN J X, ZHANG L J. Anti-inflammatory and Immunomodulatory Effects of Marine n-3 Polyunsaturated Fatty Acids on Human Health and Diseases[J]. Journal of Ocean University of China, 2019, 18(2): 481-492.

[21] PAWELCZYK T, GRANCOW M, KOTLICKA-ANTCZAK M, et al. Omega-3 Polyunsaturated Fatty Acids Can Prevent Relapse in First-episode Schizophrenia: the Results of Offer Trial[J]. European Psychiatry, 2015, 30(3): 1751.

[22] 張泉水, 林勇強, 趙虎, 等. 多不飽和脂肪酸與精神分裂癥[J]. 中國神經精神疾病雜志, 2003, 29(6): 479-480.

[23] AKHONDZADEH S. The 5-HT hypothesis of schizo- phrenia[J]. Idrugs the Investigational Drugs Journal, 2001, 4(3): 295-300.

[24] 金衛東, 趙漢清, 施建安. 不同類型精神分裂癥中樞多巴胺與5-羥色胺相互作用的比較研究[J]. 中華行為醫學與腦科學雜志, 2000, 9(2): 133-135.

[25] 金衛東, 臧德馨. 家族性與散發性精神分裂癥中樞去甲腎上腺素代謝研究[J]. 中華醫學遺傳學雜志, 1997(3): 185-186.

[26] 彭聿平, 邱一華, 張清泉, 等. 去甲腎上腺素對T淋巴細胞增殖的影響[J]. 中國應用生理學雜志, 1995(1): 75-78.

Effect of Docosapentaenoic Acid on Lymphocyte Cell Viability and Monoamine Neurotransmitter Content

LI Shu-rui1, ZHANG Cai1, ZHANG Li-qiang2, YIN Jing-wen3, YAN Hai-feng3, ZHANG Yong-ping1, ZHAO Shuai1, SONG Cai1,4

( 1.,,524088,;2.,524012,;3.,524023,4.,518120,)

To study the effect of docosapentaenoic acid (DPA) on the cell viability of peripheral blood lymphocytes and the regulation of monoamine neurotransmitters in patients with schizophrenia.Peripheral blood lymphocytes from normal subjects and patients were divided into control (CT) group, patient (SZ) group, control + DPA group (0-200 μmol/L), patient + DPA group (150 μmol/L), and cells were treated with DPA 48 hour. The cell viability was measured by CCK8 method, and the contents of dopamine and its metabolites in plasma was detected by high performance liquid chromatography, and the content of norepinephrine, dopamine, serotonin and metabolites in lymphocytes were detected.Compared with the control group, the cell viability of peripheral blood lymphocytes in patients with schizophrenia decreased. Plasma dopamine (DA) and its metabolite dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) increased, the levels of dopamine, serotonin and its metabolites in the lymphocytes decreased significantly. The ratio of DA/DOPAC, 5-HT/5-HIAA increased significantly, and the content of norepinephrine metabolites decreased significantly. DPA can significantly increase the cell viability of lymphocytes, increase the content of dopamine, serotonin and its metabolites, reduce the ratio of DA/DOPAC and 5-HT/5-HIAA, and increase the content of norepinephrine metabolites.DPA can improve the cell viability of peripheral blood lymphocytes and regulate the content of monoamine neurotransmitters in patients with schizophrenia.

docosapentaenoic acid (DPA) ; schizophrenia ; lymphocytes ; neurotransmitters

R749.3；R931.77

A

1673-9159（2020）02-0077-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.011

2019-11-17

廣東省應用型科技研發專項(2016B020235001)；湛江市科技計劃項目（2018A01045）

李舒蕊（1993－），女，碩士研究生，研究方向為精神神經免疫學和海洋活性物質研究。E-mail: lishurui1993@163.com

宋采（1956－），女，博士，教授，研究方向為精神神經免疫學和海洋活性物質藥理學。E-mail: cai.song@dal.ca

李舒蕊，張才，張理強，等. 二十二碳五烯酸對淋巴細胞活性及單胺類神經遞質的影響[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（2）：77-82.