轉錄因子CREB對合浦珠母貝無定型碳酸鈣結合蛋白啟動子的調節作用

楊 易，高 靜，陳 彥，魯 冰，謝莉萍，張榮慶

轉錄因子CREB對合浦珠母貝無定型碳酸鈣結合蛋白啟動子的調節作用

楊 易，高 靜，陳 彥，魯 冰，謝莉萍，張榮慶

（清華大學生命科學學院，北京 100084）

【】研究無定型碳酸鈣結合蛋白（ACCBP）基因的上游調控機制。以合浦珠母貝（）為研究對象，利用基因組步移技術克隆合浦珠母貝基因（）的啟動子。設計啟動子截短實驗，通過雙熒光素酶標記法確定啟動子與轉錄因子CREB的結合位點，定位啟動子中的功能元件。克隆轉錄因子環腺苷效應元件結合蛋白（CREB），并通過共轉染實驗和凝膠遷移率分析檢測啟動子的相對轉錄活性。獲得合浦珠母貝基因的啟動子序列，ACCBP啟動子在HEK-293T細胞系中轉錄活性較高；該啟動子上存在CRE元件，該元件可在轉錄過程中與CREB蛋白直接結合，大幅上調ACCBP啟動子的轉錄效率。轉錄因子CREB可通過與ACCBP啟動子上的CRE元件結合而增強轉錄活性的調控作用。

合浦珠母貝；無定型碳酸鈣結合蛋白；環腺苷效應元件結合蛋白；啟動子; 轉錄活性

生物礦化在自然界中廣泛存在。在有機大分子的精細調控下，無機物在生物體內特定部位有序沉積，形成骨骼、牙齒、殼體和珍珠等有特殊結構和功能的礦物[1]。軟體動物的殼和珍珠因有優良的物理特性和藥用價值而廣受關注。珍珠培育主要貝類合浦珠母貝是生物礦化領域重要研究對象之一[2-4]。

合浦珠母貝的貝殼和珍珠有相似的結構特點。貝殼分為外側的棱柱層和內側的珍珠層兩個鈣化層[5]。貝殼的形成受以基質蛋白為主的多種有機大分子的調控，基質蛋白起重要調控作用[6-7]。目前已發現數十種基質蛋白在殼體的晶體成核、取向、晶型調節等方面起重要作用。例如，Nacrein蛋白存在于棱柱層和珍珠層中，有碳酸酐酶活性，可通過提供碳酸氫根離子調節碳酸鈣晶體的形成[8]；Pearlin蛋白主要存在于珍珠層中，通過與碳酸鈣底物結合而特異性地使碳酸鈣形成文石晶體；Aspein可誘導棱柱層中方解石晶體的形成[9]。無定形碳酸鈣結合蛋白（Amorphous Calcium Carbonate Binding Protein，ACCBP）是從合浦珠母貝外套膜外液中提取的一種基質蛋白[10]，也是維持合浦珠母貝珍珠層文石晶體有序生長和體液系統中碳酸鈣過飽和狀態的重要功能因子[11]，還是一種碳酸鈣結晶的強抑制劑，可通過結合作用抑制碳酸鈣晶體的成核，使其以無定形狀態穩定存在[12]。ACCBP為間液蛋白，參與無定型碳酸鈣（ACC）轉化過程中的晶型選擇，可通過調控ACC周圍的鈣鎂例子濃度比誘導ACC向文石晶體轉化。在細胞囊泡內，ACCBP與鎂離子協同誘導ACC的形成[11]。可見，ACCBP可直接影響母貝中的礦化過程。

目前，鮮見關于基質蛋白上游調控機理的研究報道。編碼基質蛋白的基因在細胞內受到何種上游調控是值得研究的課題。筆者基于對基質蛋白功能的研究結果，探究在ACCBP轉錄調控中起關鍵影響的轉錄因子，并確定該轉錄因子的結合位點，有助于理解基質蛋白產生過程的完整信號通路，搭建基質蛋白上游調控的信息網絡框架。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用合浦珠母貝取自廣西壯族自治區北海市珍珠養殖場，實驗個體均為健康的成體貝，貝殼完整厚度均勻，表面附有大量足絲，使貝之間穩固相連。實驗前，貝體放于人工海水缸中，于25℃室溫下培養。用于培養的人工海水中含有與海水等滲的鈉、鉀、鈣、鎂離子。

1.2 總DNA提取和ACCBP基因啟動子克隆

剖取合浦珠母貝閉殼肌組織，加液氮充分研磨。用海洋動物DNA提取試劑盒(DP324，Tiangen) 提取總DNA，并以瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測其濃度和純度。基于已知的基因序列[12]設計引物，進行上游基因組步移。由多次基因組步移結果獲得基因啟動子的拼接序列，再用高保真聚合酶KOD (Toyobo) 檢測，確定最終的啟動子序列。所用引物見表1。

1.3 CREB基因克隆

通過反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）進行。剖取合浦珠母貝外套膜組織，加液氮充分研磨。用試劑盒TRIzol (Trizol Reagent for Total RNA Extraction, Invitrogen) 提取總RNA，并以甲醛變性電泳和分光光度計檢測其濃度和完整性。基于基因序列[14]設計引物，克隆得到合浦珠母貝基因的開放閱讀框，再用高保真聚合酶KOD (Toyobo) 擴增并測序。所用引物見表1。

1.4 重組質粒的構建

將全長2.3 kb的ACCBP啟動子與熒光素酶載體pGL4.10 (Promega) 連接，構成重組表達載體AC-pGL4.10。將所得載體轉化入感受態細胞Tran5α進行亞克隆并提純保存。使用BDGP在線分析軟件計算并分析完整啟動子序列，預測啟動子上CRE元件的位置。根據預測結果，對完整啟動子進行不同程度的截短。對完整啟動子在預測的CRE位點做不同程度的突變，獲得3種啟動子突變體，分別為AC-mu-1 (替換了2個堿基)，AC-mu-2 (替換了4個堿基)，AC-mu-3 (替換了8個堿基)，構建突變體所用的全部引物見表1。給獲取的每種截短體和突變體分別構建pGL4.10表達載體。

將反轉錄獲得的基因與表達載體pcDNA3.1(+)-myc(Invitrogen) 連接，構成表達載體CREB-pcDNA3.1(+)-myc。將所得載體轉化入感受態細胞Tran5α進行亞克隆并提純保存。

1.5 細胞轉染以及轉錄活性檢測

向DMEM緩沖液 (Gibco) 中加入體積分數10%的胎牛血清，制成細胞培養液。在37 ℃、CO2體積分數5%的條件下培養HEK-293T細胞。轉染時，用轉染試劑VigoFect(Vigorous)，將構建的pGL4.10重組質粒與參照載體pRL-TK (Promega) 進行共轉染。轉染時用透明48孔板培養細胞，每組細胞使用500 ng pGL4.10重組質粒和5 ng pRL-TK轉染。在驗證啟動子與轉錄因子相互作用的實驗中，還在上述基礎上同時轉染500 ng CREB-pcDNA3.1(+)的重組質粒或pcDNA3.1(+)空質粒。

表1 實驗中所使用的引物

將轉染后細胞繼續培養36 h后進行熒光素酶檢測。用細胞裂解液Passive lysis buffer (Promega)在室溫下將細胞充分裂解。用多功能讀數儀VarioskanTMFlash (Thermo Scientific) 檢測啟動子相對轉錄活性。

1.6 電泳遷移率分析(EMSA)

分別將轉染的CREB-pcDNA3.1(+)-myc重組質粒和pcDNA3.1(+)-myc空質粒的HEK-293T細胞培養24 h。用細胞核抽提試劑NE-PER (Thermo Scientific) 抽提兩組細胞的細胞核蛋白，提取物保存在-80℃下待用。EMSA分析前，用蛋白質檢測試劑PierceTMBCA (Thermo Scientific) 檢測提取的核蛋白濃度。EMSA分析所用引物由5′ 端生物素標記的互補單鏈DNA退火合成。同時設計未加生物素標記的探針作為對照。探針具體信息見表2。用化學發光EMSA分析試劑盒LightShiftTM(Thermo Scientific) 進行EMSA分析。每個電泳泳道核蛋白提取物用量5 μg，已標記探針用量5 ng，在不同實驗組中分別加入50倍競爭探針、100倍競爭探針和抗體，泳道安排詳見2.4部分圖4注釋。實驗結果使用化學發光成像系統(Thermo Scientific) 檢測。

表2 EMSA分析用探針

2 結果與分析

2.1 基質蛋白ACCBP的基因啟動子和轉錄因子CREB基因

克隆的基因啟動子片段全長2 374 bp，由兩次基因組步移獲取的片段拼接而成，序列如圖1所示。根據BDGP在線軟件分析和RACE檢測結果，比較分析獲得的啟動子轉錄起始位點（圖1）。根據轉錄起始位點可將片段全長記為（-2 269，+105）。

所克隆轉錄因子CREB的基因片段開放閱讀框序列長度為1 728 bp，編碼576個氨基酸。

方框加粗字符為轉錄起始位點The transcriptional initiation site marked by framed bold letter

圖1 ACCBP基因的啟動子全序列

Fig. 1 Sequence of the promoter of gene ACCBP

2.2 ACCBP啟動子及其截短體的轉錄活性

將構建的ACCBP啟動子亞克隆載體AC-pGL4.10轉染到HEK-293T細胞系中培養，用雙熒光素酶報告方法以及所構建的啟動子截短體載體檢測其轉錄活性，獲得不同長度啟動子截短體的轉錄活性。雙熒光素酶報告結果如圖2所示。圖2可見，重組載體AC-pGL4.10的轉錄活性是空載體pGL4.10的28倍，即表示啟動子在HEK-293T細胞系中轉錄活性較高。對比tru-1和tru-2可發現，差異區域（-2 192，-2 082）的缺失使啟動子的轉錄活性大幅降低。同時，由軟件預測的CRE元件位置為（-2 126，-2 118）。該預測結果在定位上與截短體檢測結果相符合，表明該區域含有影響啟動子轉錄活性的重要元件CRE。同時tru-7轉錄活性明顯降低，是RNA聚合酶結合位點不完整所致。

2.3 轉錄因子CREB對ACCBP啟動子轉錄活性的影響

將CREB-pcDNA3.1(+)-myc與ACCBP啟動子載體（AC-pGL4.10）共轉染入HEK-293T細胞系中培養，同時將3種突變體的pGL載體與CREB-pcDNA3.1(+)-myc共轉作為參照。雙熒光素酶報告結果見圖3。圖3可見，轉錄因子CREB可大幅上調ACCBP啟動子的轉錄活性，卻對空載體的轉錄活性無影響。對3種突變的啟動子而言，在CRE位點的突變程度越大，該突變體受到CREB的上調作用越小。可見，轉錄因子CREB通過與CRE位點的特定序列相互作用，增強ACCBP啟動子的轉錄活性。特定序列的丟失導致啟動子對CREB的應答效果減弱甚至消失。

A，啟動子和截短體構成的表達載體示意圖，包含完整啟動子、7種截短體以及空載體的表達載體；B，每種表達載體對應的雙熒光素酶報告系統檢測結果。圖中相對熒光素酶活性即表示對應表達載體的轉錄活性；截短體tru-1與tru-2的轉錄活性差異明顯，為15個單位。

圖3 轉錄因子CREB對ACCBP啟動子及其截短體轉錄活性的影響

2.4 轉錄因子CREB與CRE位點的結合

電泳遷移率分析的電泳結果如圖4所示。圖4中泳道1和6為空白對照。泳道3表明，CREB蛋白與帶生物素標記的CRE探針可形成DNA-蛋白質復合物。泳道2和5表明，在50倍和100倍濃度未標記探針的競爭作用下，被標記探針的遷移帶因受競爭而分離，且100倍濃度的競爭效果強于50倍。泳道4中，在myc抗體的影響下，探針、蛋白、抗體相互結合而形成超遷移帶。泳道7和8為陰性對照，探針與未轉染CREB的核蛋白提取物未見顯著結合。可見，轉錄因子CREB通過與啟動子DNA上CRE元件的直接結合調節ACCBP啟動子的轉錄活性。

圖4 EMSA實驗結果

3 討論

目前，對基質蛋白在合浦珠母貝礦化過程中的核心作用已有廣泛研究，但這些蛋白編碼基因的上游調控機制仍待闡明。因此，解析基質蛋白ACCBP在合浦珠母貝中的上游調控機理有重要意義。

軟體動物貝殼與脊椎動物骨骼一樣，為生物礦化的產物。在哺乳動物中，骨骼發育等調控機理已有較為成熟的研究成果。研究發現，與在某些哺乳動物中起重要調控作用的轉錄因子（Pf-AP-1、Pf-Rel等）同源的轉錄因子在合浦珠母貝中亦可調控基質蛋白的表達[13]。本研究涉及的轉錄因子CREB在人神經系統發育中的促進作用廣受關注[14]。

轉錄因子CREB由兩個結構域組成，一是含堿性亮氨酸拉鏈結構的激酶誘導區域，包括多個磷酸化位點，可被PKA、PKC等多種蛋白激酶磷酸化；二是富含谷氨酰胺殘基的區域，與RNA聚合酶的結合有關。CREB通過與其下游啟動子區的CRE元件（環腺苷效應元件）結合發揮作用。CRE元件含有高度保守的8堿基回文序列，即5′-TGACGT CA-3′。在應激狀態下，CREB作為一種細胞核內調控因子與CRE元件結合，通過自身磷酸化實現調節轉錄的功能。而在穩態條件下，CREB的異構體以無活性非磷酸化的形式存在。本研究中，由于現有研究對CRE元件的了解較為清晰明確，在啟動子上易定位到該元件。對CRE元件位點的突變試驗顯示，該位點的突變既使啟動子的轉錄活性大幅下降，又減弱了轉錄因子CREB對啟動子的激活作用，且這兩種影響與突變程度呈正相關性，表明CRE元件在轉錄調控中有重要作用。

為進一步說明CREB可通過與啟動子上的CRE位點直接結合而起調控轉錄活性作用，筆者設計EMSA實驗來驗證兩者體外結合能力的強度。結果表明，合浦珠母貝CREB基因在HEK-293T細胞系中表達的核蛋白可與ACCBP啟動子中的CRE元件特異性結合，且該結合作用可被特異性競爭取代。未轉染CREB的核蛋白提取物與探針無顯著結合的結果，以及在myc抗體的作用下形成超遷移帶的現象，均為CREB與ACCBP啟動子上CRE位點的特異性結合提供了證據。

4 結語

本研究證明，ACCBP啟動子的轉錄活性受轉錄因子CREB的正向調控。然而，細胞內的基因調控并不是單一、單向的。上述調控是否存在反饋機制，以及調控過程中是否存在多種轉錄因子的劑量效應，有待于進一步研究。未來研究應進一步加強對基質蛋白基因調控因子的挖掘，同時進一步了解調控的機理和反饋機制，以期最終構建出調控啟動子轉錄活性的分子調控網絡。

[1] KRAMPITZ G, GRASER G. Molecular mechanisms of biomineralization in the formation of calcified shells.[J]. Angew Chem Int Ed Engl, 1988, 27(9): 1145-1156.

[2] WHALEY S R, ENGLISH D S, HU E L, et al. Selection of peptides with semiconductor binding specificity for directed nanocrystal assembly[J]. Nature, 2000, 405 (6787): 665-668.

[3] BOSKEY A L. Biomineralization: Conflicts, challenges, and opportunities [J]. Cell Biochem, 1998: 83-91.

[4] STUPP S I, BRAUN P V. Molecular manipulation of microstructures: Biomaterials, ceramics, and semicondu- ctors[J]. Science, 1997, 277(5330): 1242-1248.

[5] WEINER S, TRAUB W, PARKER S B. Macromolecules in mollusc shells and their functions in biomineralization [and discussion] [J]. Phil Trans R Soc Lond B, 1984, 304(1121): 421-438.

[6] 劉世婷，蘇境坦，劉駿, 等. 合浦珠母貝無定形碳酸鈣結合蛋白功能性肽段篩選及體外功能探究[J]. 廣東海洋大學學報, 2012, 32(3): 6-12.

[7] 吳晨，蘇境坦，梁健, 等. 合浦珠母貝基質蛋白KRMP-3對二價金屬離子選擇性的研究[J]. 海洋科學, 2013 (4): 26-31.

[8] KEITH J, STOCKWELL S, BALL D, et al. Comparative-analysis of macromolecules in mollusk shells[J]. Comp Biochem Physiol B, 1993, 105（3-4）: 487-496.

[9] DAUPHIN Y, CUIF J P, DOUCET J, et al. In situ chemical speciation of sulfur in calcitic biominerals and the simple prism concept [J]. J Struct Biol, 2003, 142（2）: 272-280.

[10] MA Z J, HUANG J, SUN J, et al. A novel extrapallial fluid protein controls the morphology of nacre lamellae in the pearl oyster,[J]. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282(32):23253-63.

[11] LIU, X J, LI J L, XIANG L, et al. The role of matrix proteins in the control of nacreous layer deposition during pearl formation [J]. Proc Biol Sci, 2012, 279(1730): 1000-1007.

[12] SU J T, ZHU FJ, ZHANG G Y, et al. Transformation of amorphous calcium carbonate nanoparticles into aragonite controlled by ACCBP [J]. Crystengcomm, 2016, 18(12): 2125-2134.

[13] ZHENG X N, CHENG M Z, XIANG L, et al. The AP-1 transcription factor homolog Pf-AP-1 activates transcription of multiple biomineral proteins and potentially participates inbiomineralization [J]. Scientific Reports, 2015, 5: 14408.

[14] CHEN G Q，ZOU X Y，WATANABE H, et al. CREB binding protein is required for both short-term and long-term memory formation [J]. The Journal of Neuroscience, 2010, 30(39): 13066-13077.

Regulation of ACCBP Promoter by Transcription Factor CREB in

YANG Yi, GAO Jing, CHEN Yan, LU Bing, XIE Li-ping, ZHANG Rong-qing

（,,100084,）

【】To study the promoter region in the regulatory mechanism of.【】The promoter ofwere cloned by genome-walking PCR. Promoter deletion analysis clones were produced for the dual-luciferase reporter assay to find the binding site of transcription factor CREB, and locate the functional element of the promoter. A classic transcription factor, cAMP-response element binding protein (CREB), was cloned for transient co-transfection assays and electrophoretic mobility shift assay for detecting the relative transcription activity of the promoter. 【】The promoter ofwas sequenced, and the promoter showed high transcription activity in cell line HEK-239T. The promoter was confirmed to have a CRE element that interacted with CREB and resulted in enhancing the transcription efficiency 【】CREB can enhance the transcription ability ofby binding the CRE site on the promoter.

; Amorphous Calcium Carbonate Binding Protein; cAMP-response element binding protein; promoter; transcription ability

Q493.2

A

1673-9159（2020）02-0007-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.002

2017-05-09

清華大學研究生院基金“生物礦化細胞對珍珠層形成的作用及其調控機制”（31372502）

楊易（1992－），男，碩士，專業方向為海洋生物學。

張榮慶，男，教授。E-mail：rqzhang@mail.tsinghua.edu.cn

楊易，高靜，陳彥，等. 轉錄因子CREB對合浦珠母貝無定型碳酸鈣結合蛋白啟動子的調節作用[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（2）：7-12.

（責任編輯：劉慶穎）