超高壓結合酶解法提取魚油工藝優化

張淵超，孫欽秀，魏 帥，劉書成，吉宏武，郝記明，毛偉杰，高 靜

超高壓結合酶解法提取魚油工藝優化

張淵超，孫欽秀，魏 帥，劉書成，吉宏武，郝記明，毛偉杰，高 靜

（1. 廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術研發中心，廣東省海洋生物制品工程重點實驗室，水產品深加工廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524088；2. 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，大連工業大學，遼寧 大連 116034；3. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室，廣東 湛江 524088）

【】優化黃鰭金槍魚（）副產品（魚頭）提取魚油的工藝參數。以魚油提取率為評價指標，采用單因素實驗確定最佳超高壓處理壓強和保壓時間，采用Box-Behnken響應面試驗設計優化關鍵酶解工藝參數。建立魚油提取率與加酶量、液料質量比、酶解溫度和酶解時間之間的回歸模型，加酶量、液料質量比、酶解溫度和酶解時間對魚油提取率均有顯著影響（< 0.05），影響由高到低依次為加酶量、液料質量比、酶解時間、酶解溫度；當超高壓處理壓強200 MPa、處理時間10 min、加酶量（質量分數）為1.125%、液料質量比為1∶1、酶解溫度65 ℃和酶解時間60 min時，根據質量法計算，魚油提取率達99.51%，與模型預測值之間差異無統計學意義（> 0.05）。采用響應面法建立的回歸模型較好地描述超高壓結合酶解提取魚油的工藝過程，優化的工藝參數可有效提高魚油提取率。

魚油；提取工藝；提取率；超高壓；酶解

魚油因富含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等-3多不飽和脂肪酸而具有眾多優良的生理活性，在醫藥和保健品領域受到高度關注。生產魚油的原料主要是魚類加工副產物，其脂肪質量分數為1.4％~ 40.1％，脂肪含量的高低主要取決于魚的種類和部位[1]。在海水魚類中，脂肪主要沉積在皮膚下以及肌肉、頭部和內臟中[2]。金槍魚是大型海洋洄游魚類，加工以生魚片和罐頭為主，其加工副產物約占總質量的50% ~ 60%，主要有魚頭、魚骨和內臟等[3]，是生產高品質魚油的良好生物資源[4-11]。

傳統的魚油提取方法有壓榨法[10]、蒸煮法[11]、溶劑法[12]等。壓榨法和蒸煮法的魚油提取率較低，品質較差；溶劑法易造成溶劑殘留。近年來，新型綠色魚油提取方法漸受關注，主要有酶解法[13]、超臨界CO2萃取[14-15]、超聲波輔助提取[16]等。本課題組前期利用酶解法從黃鰭金槍魚魚頭中提取魚油，提高了魚油的品質，但魚油提取率仍偏低[17-18]。超高壓（Ultra-high pressure，UHP）是一種在高壓條件下使食品物理化學性質迅速發生改變的非熱加工技術[19]，可在一定程度上破壞生物組織，促進生物活性物質從細胞內滲出，從而提高有效成分的提取率[20]。本研究在前期酶解提取魚油的基礎上，結合超高壓輔助提取活性物質的優點，以黃鰭金槍魚（）魚頭為原料，以魚油提取率為指標，考察超高壓結合酶解條件對魚油提取率的影響，優化魚油提取工藝參數，以實現魚油的高效提取。

1 材料與方法

1.1 材料

冷凍黃鰭金槍魚魚頭，質量（1.53±0.37）kg，購于山東省青島市市場，以-18℃條件運輸至實驗室。聚乙烯（polyethylene，PE）/聚酰胺（polymide，PA）復合包裝袋，購于雄縣旭日紙塑包裝有限公司。木瓜蛋白酶，購于廣西南寧龐博生物工程有限公司，酶活力為105U/g。

1.2 方法

1.2.1 魚頭碎骨肉制備 清水沖洗金槍魚魚頭表面的雜質，用電鋸將金槍魚魚頭切割成小塊，用粉碎機將其均勻絞碎。絞碎后的碎骨肉真空封裝于包裝袋中，置于-80℃超低溫冰箱中凍藏。使用前18 h取出，置于4℃冰箱中解凍至中心溫度為4℃。

1.2.2 超高壓結合酶解法提取金槍魚魚油 稱取金槍魚魚頭碎骨肉50 g，封裝于真空包裝袋中，置于超高壓設備（HPP. L2-600/0.6型，天津華泰森淼生物工程技術有限公司）超高壓處理釜中，在100、200、300、400 MPa下分別處理5、10、20、30 min，卸壓，取出樣品放入燒杯中；以碎骨肉質量為基準，按照一定比例加入蒸餾水和木瓜蛋白酶，在一定溫度下恒溫攪拌一段時間。酶解結束后，酶解產物在10 000 r/min條件下離心20 min，分離上層油相即為粗魚油。

1.2.3 試驗設計 以魚油提取率（）為試驗指標，以加酶量（1）、液料比（2）、酶解溫度（3）和酶解時間（4）為試驗因素，采用Box-Behnken試驗設計和回歸分析探討酶解條件對魚油提取率的影響規律。依據蛋白酶最適條件范圍，選擇合適的因素水平并對其進行編碼（表1）。

表1 因素水平編碼值

加酶量是以碎骨肉的質量（g）為基準按照質量百分比加入。液料比是指酶解體系中加水質量（g）與碎骨肉質量（g）的比值。魚油提取率用質量法計算，即提取魚油的質量（g）與碎骨肉的脂肪質量的比值。碎骨肉的脂肪含量用索氏抽提法[21]測定。魚油提取率計算公式：

魚油提取率 = 魚油質量/(樣品質量×粗脂肪質量分數)]。

1.3 數據處理

每個試驗重復3次，結果用平均值±標準差表示。采用JMP10.0統計軟件進行數據處理。

2 結果與討論

2.1 超高壓處理條件對魚油提取率的影響

從圖1可見，當超高壓處理時間為5、10 min時，魚油提取率隨處理壓強的增加呈先升后降的變化趨勢；當超高壓處理時間為20、30 min時，魚油提取率隨著處理壓強的增加呈現下降的趨勢。

圖1 不同超高壓壓力對魚油提取率的影響

圖2可見，在處理壓強相同時，魚油提取率隨著處理時間的延長，呈先升后降的變化趨勢。這是因為在超高壓處理過程中，細胞內外形成巨大的壓力差，使金槍魚細胞結構破裂，加速細胞內物質流出，在酶解過程中蛋白酶更易于降解蛋白質，從而加速了魚油的滲透速率，提高了魚油提取率。但是，當超高壓處理壓強超過300 MPa或保壓時間超過20 min時，持續的較大壓力差使魚肉細胞中的大分子物質滲出，造成溶質堵塞通道，從而減慢了魚油的滲透速率，造成魚油提取率降低。這種現象與尹琳琳等[22]、魏煒等[23]發現的規律基本吻合。

圖2保壓時間對魚油提取率的影響

從圖1可見，魚油提取率達到峰值的條件組合分別是100 MPa、20 min和200 MPa、10 min，兩者的魚油提取率均接近100%。通過觀察兩種條件下的魚油色澤（圖3），發現200 MPa、10 min條件下魚油色澤淡于100 MPa、15 min。依據中華人民共和國水產行業標準SC/T 3502-2016[24]，品質較好的魚油應呈淺黃色、有微量混濁和沉淀。從圖3可見，超高壓200 MPa作用10 min后提取的魚油顏色較淺，沉淀量較少。因此，綜合考慮魚油提取率、色澤和沉淀量，選擇超高壓處理條件為200 MPa、10 min。

圖3 兩種不同條件下的魚油外觀

2.2 酶解法提取魚油回歸模型的建立

依據Box-Behnken試驗設計和表1的因素水平編碼表，建立酶解法提取金槍魚魚油的試驗方案，測定其魚油提取率，結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計的方案與結果

對表2數據進行回歸分析，并剔除不顯著變量后，建立回歸模型如下：

= 86.05 + 2.721- 4.852+ 1.203+ 1.594- 1.7012+ 2.3213- 3.6123+ 1.5014- 2.5134+ 4.9812+ 2.9142

對該回歸模型的系數進行顯著性檢驗，結果見表3。從表3可知，回歸模型的每一項對魚油提取率的影響均顯著（< 0.05）。對該回歸模型進行正則變換，如下：

= 86.05 + 5.5812+ 3.522+ 0.7932- 2.0042。

表3 回歸模型的系數及其顯著性檢驗

注：*表示< 0.05，影響顯著。

Note: * means< 0.05, significant effect.

Box-Behnken試驗設計將加酶量、液料比、酶解溫度和酶解時間進行了編碼，消除了各因素單位的影響，因此，可根據回歸模型正則形式的系數絕對值大小判斷各因素對魚油提取率影響的主次關系[24]。各因素對魚油提取率影響大小順序為加酶量（1）、液料比（2）、酶解時間（4）、酶解溫度（3）。

利用回歸模型對表2試驗條件下魚油提取率進行預測，并與魚油提取率的試驗值進行線性相關分析，結果見圖4。從圖4可以看出，魚油提取率的預測值與試驗值呈較好的線性相關，決定系數2= 0.98，均方根誤差RMSE = 0.883 2。這說明回歸模型可解釋加酶量、液料比、酶解溫度和酶解時間引起的98%的魚油提取率變化，因此，建立的回歸模型參考價值較高[25]。對回歸模型進行方差分析和失擬性檢驗，結果見表4。從表4可見，回歸模型顯著（< 0.05），而失擬性不顯著（> 0.05），表明模型在自變量變化范圍內[-1，1]的擬合是可行的。

綜合回歸模型的系數顯著性檢驗、決定系數、方差分析和失擬性檢驗等結果[24]，充分說明建立的回歸模型可用于預測在不同加酶量、液料比、酶解溫度和酶解時間處理下的魚油提取率，可以用來優化工藝參數。

圖4 魚油提取率的試驗值與模型預測值之間的相關性

表4 回歸模型的方差分析和失擬性檢驗

注：*表示< 0.05，影響顯著。

Note: * means< 0.05, significant effect.

2.3 酶解提取魚油工藝參數的優化

利用JMP10.0數據處理軟件的預測刻畫器功能優化酶解提取魚油的工藝參數，結果見圖5。從圖5可見，在試驗范圍內，當1= 0.25、2= -1、3= 1、4= -1時，即加酶量為1.125%、液料比為1∶1、酶解溫度為65 ℃、酶解時間為60 min時，魚油提取率試驗值為99.51%，模型預測值為100%，兩者之間無顯著性差異（> 0.05）。根據表2中數據也可以得出：當加酶量為1.5%、液料比為2∶1、酶解溫度45 ℃、酶解時間180 min，魚油提取率為99.78%；當加酶量為1.5%、液料比為1∶1、酶解溫度55℃、酶解時間120 min，魚油提取率為99.22%；與本實驗中預測刻畫器得到的最優條件魚油提取率99.51%之間差異無統計學意義（> 0.05）。但是，加酶量越大，生產成本越高；酶解時間增加，則魚油在空氣中的暴露時間增加，進而魚油發生氧化而使魚油品質降低[26]。預測刻畫器優化的酶解條件，不僅加酶量低而且酶解時間短，有效減輕因脂肪氧化造成魚油品質下降問題。綜上，選擇酶解提取魚油的最優條件為：加酶量為1.125%，液料比為1∶1，酶解溫度65℃，酶解時間60 min。

圖5 魚油提取率的預測優化

魚油提取最優工藝參數的預測值和實驗值相符，再次說明所建回歸模型可用于預測超高壓預處理后，在不同加酶量、液料比、酶解溫度和酶解時間處理下的魚油提取率。因此，可用模型優化工藝參數，且可分析加酶量、液料比、酶解溫度和酶解時間對魚油提取率的影響規律。

由于回歸模型中的變量是編碼值，需要將表1中的編碼值公式代入回歸模型中，如下：

= 69.49 - 59.121+ 18.412+ 0.883- 0.454+ 19.9212+ 0.4613+ 0.0514- 3.4012- 0.3623。

該回歸模型即為魚油提取率（）與實際變量加酶量（1）、液料比（2）、酶解溫度（3）和酶解時間（4）之間關系的數學表達式。

3 結論

利用單因素實驗確定超高壓處理的最適條件，利用Box-Behnken響應面試驗設計和回歸分析優化酶解提取魚油的最佳工藝參數，即當超高壓處理壓強200 MPa、處理時間10 min、加酶量為1.125%、液料比為1∶1、酶解溫度65 ℃、酶解時間60 min時，魚油提取率達99.51%。

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Optimization of Extraction Parameter of Fish Oil by Ultra-high Pressure Combined with Enzymatic Hydrolysis

ZHANG Yuan-chao, SUN Qin-xiu, WEI Shuai, LIU Shu-cheng, JI Hong-wu, HAO Ji-ming, MAO Wei-jie, GAO Jing

（1.,,,,,524088,; 2.,116034,; 3.,524088,）

To optimize the extraction parameters of tuna oil from tuna heads.Using the fish oil extraction efficency as an index, the optimal treatment pressure, holding-time and the Box-Behnken response surface experimental design was used to optimize the key enzymatic parameters.A regression model was established between the fish oil extraction efficiency and the amount of enzyme added, the ratio of liquid to material, the temperature and time used in enzymatic hydrolysis. These factors affected the extraction efficiency of fish oil significantly (< 0.05), and the order of influence was as follows: the amount of enzyme > the ratio of liquid to material> the time of hydrolysis > the temperature of hydrolysis. When the ultra-high pressure treatment pressure was 200 MPa, the processing time was 10 minutes, the added enzyme added was 1.125%, the ratio of liquid to material was 1∶1, the enzymatic hydrolysis temperature was 65 ℃ and the enzymatic hydrolysis time was 60 min. Based on the gravimetric method, the extraction efficiency of fish oil can reach 99.5%. The experimental value was no significant difference from the model prediction value (> 0.05).The regression model established by the response surface method can better describe the extraction process of fish oil by ultra-high pressure combined with enzymatic hydrolysis, and the optimized process parameters can effectively improve the extraction ratio of fish oil.

fish oil; extraction technology; extraction ratio; ultra-high pressure; enzymatic hydrolysis;

TS225.2+4

A

1673-9159（2020）02-0071-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.010

2019-12-23

南方海洋科學與工程廣東省實驗室（湛江）（ZJW-2019-06）；國家自然科學基金面上項目（31771997）；廣東海洋大學創新強校重大培育項目（GDOU2017052603）；廣東普通高等學校水產品加工與利用創新團隊項目（GDOU201603503）

張淵超（1995－），男，碩士研究生，研究方向為海洋食品加工新技術。E-mail：2560157927@qq.com

孫欽秀（1986－），女，博士，研究方向為海洋食品加工新技術。E-mail：sunqinxiugo@163.com

劉書成（1977－），男，教授，研究方向為海洋食品加工新技術。E-mail：Lsc771017@163.com

張淵超，孫欽秀，魏帥，等. 超高壓結合酶解法提取魚油工藝優化[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（2）：71-76.

（責任編輯：劉慶穎）