柿雄花表型及花粉形態多樣性研究

索玉靜 孫 鵬* 韓衛娟 刁松鋒 傅建敏 李芳東

(1. 國家林業局泡桐研究開發中心，鄭州 450003；2.中國林業科學研究院 經濟林研究開發中心，鄭州 450003)

柿(DisopyroskakiThunb.)為柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros)植物，原產我國，是一種具有近萬年歷史的傳統木本糧食樹種，由野生馴化為栽培柿也有近2 000多年的歷史[1]。柿果實汁多味甜，富含多糖、黃酮、酚類及維生素C等多種營養物質，深受人們喜愛；柿葉和柿果還富含單寧類物質，在食品、保健、化工和醫藥等領域具有廣闊的開發價值和應用潛力[2-4]。據聯合國糧農組織(FAO)統計，2014年我國柿栽培面積約93.72萬hm2，年產量高達380.36萬t，均占世界第一。

柿樹單性結實力很強，長久以來由于人們對柿果實的追求，野生雄株被人為的砍伐或改接，造成了絕大多數柿品種只開雌花，少量雌雄同株，完全雄性資源罕見的現狀[5-6]。雖然生產上一般無需配置授粉樹，但在種質創新和良種培育方面，雄性種質作為授粉父本的育種價值不容忽視[7-8]。本研究團隊對柿分布區進行了廣泛的野生雄性資源調查，結果發現在秦淮以南多地發現野生柿自然居群和柿野生完全雄性種質資源。這些新發現的野生資源、尤其是野生雄性資源的分類學地位尚不清楚，對其進行表型形態特征及遺傳多樣性評價，是柿雄性種質資源高效利用的基礎。王麗媛等[9]利用SSR分子標記技術，對193份柿雄性種質資源及主栽甜澀柿品種和近緣種進行了遺傳多樣性分析；而若想對這類資源進行種質鑒定及綜合評價，還需對其表型指標進行評價。此外，花粉微觀形態特征在植物種質鑒定中被廣泛應用[10]，但目前關于柿雄性種質花粉微觀形態的研究多集中在少數柿屬植物代表種之間[11-12]，關于柿種內雄性資源間花粉微觀形態指標的差異尚未見報道。

目前，已頒布的《柿種質資源描述規范和數據標準》[13]和《柿新品種特異性、一致性和穩定性測試指南》(2010)兩項標準中均缺乏柿雄性資源表型，尤其是雄花表型特征的相關描述，為柿雄性種質資源的評價和新品種選育造成困難。因此，本研究旨在通過對柿雄性種質資源的雄花表型形態特征進行評價，填補目前柿種質資源描述標準中關于雄性資源表型特征描述的空白，以期為后續柿雄性種質資源的評價及新品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以柿及其近緣種共計93份雄性種質資源為試驗材料，其中來自廣西、湖北、江西、江蘇、湖南、河南、陜西、貴州、臺灣等省份的柿雄性種質資源63份，包括各地野生資源、主栽品種及農家品種；此外，還包括日本起源的各類型(甜澀)柿雄性種質共計22份，油柿、浙江柿、美洲柿、君遷子等近緣種共計8份。江西野柿、江蘇野柿、湖南野柿、湖北羅田野柿和富有F1的種子于2011年收集，2012年播種于原陽試驗基地，于2016年花期采集本研究所需雄花，其余試驗材料采集于各資源的起源地或西北農林科技大學園藝學院國家柿種質資源圃，詳見表1。

表1 試驗材料類型、來源及采集地Table 1 Material types, origins and collecting zones

表1(續)

表1(續)

表1(續)

1.2 表型測定

每份資源選取剛開放的雄花10朵，測定其花筒直徑、花筒高、雄蕊數、最短雄蕊長、最長雄蕊長、雄蕊寬、萼片長、萼片寬、萼片數量、花托高、花托寬、花柄長和花柄寬等13個表型指標。收集其中33份雄性種質資源的花粉，將鮮樣用雙面膠粘在金屬臺上，經HITACHI E-1010型離子濺射儀噴金、鍍膜，置于HITACHI S-3400N型掃描電鏡中觀察和拍照。

1.3 數據分析

采用SPSS.20.0軟件包(SPSS.inc.，USA)計算各資源13個表型指標的均值和標準誤。利用單因素方差分析法，對不同來源地和不同類型(甜澀)的資源分別進行組內和組間顯著性差異分析，如果存在顯著性差異，則用Tukey HSD法進行多重比較(P<0.05)；利用相同方法對種間資源表型及33份資源花粉長度、寬度和表面條紋長度進行差異顯著性分析。最后利用主成分法和系統聚類法進行降維和聚類分析[14]。

2 結果與分析

將85份柿種內雄性資源根據其來源地及甜澀類型，劃分為10個類別，即廣西、木蘭山、云架山、江西、江蘇、湖南和羅田等野柿雄株，及常見甜柿、澀柿和‘富有’與‘赤柿’雜交F1代類別。通過對85份柿種內雄性資源及8份柿近緣種雄性資源的13個雄花表型指標進行測量和統計分析，研究柿屬種間和柿種內各類別資源雄花表型指標的差異。部分資源雄花表型見圖1。

圖1 部分柿及其近緣種資源的雄花表型圖Fig.1 The male flower phenotype of some persimmon and its related species

2.1 種間資源的雄花表型指標比較

對柿及其近緣種間雄性資源雄花表型指標進行比較分析，結果表明：柿與油柿、美洲柿、浙江柿、君遷子等近緣種在雄花最長雄蕊長、萼片長和花柄長等表型指標上存在顯著差異；其中，柿的最長雄蕊長顯著高于油柿，萼片長顯著高于浙江柿和君遷子，花柄長均顯著高于4個近緣種。此外，油柿的萼片寬和花托高均顯著高于美洲柿，而與其他種間的差異未達到顯著水平(表2)。

2.2 不同來源地和類型內部資源間雄花表型指標差異顯著性分析

對10個類別的柿種內雄性資源雄花表型進行測量統計，分析不同來源地和類型內部資源間雄花表型指標的差異程度。從表3可以看出，廣西各資源間花筒直徑不存在顯著性差異；木蘭山資源間雄蕊寬和萼片數量不存在顯著性差異；江西野柿資源間花筒高、雄蕊數、花序柄長、花柄長和不存在顯著性差異；江蘇野柿雄蕊數不存在顯著性差異；湖南野柿間花筒直徑、雄蕊數、最長雄蕊長、萼片長、花托高、花序柄長和花柄粗不存在顯著性差異；羅田野柿間花筒高、最短雄蕊長、最長雄蕊長、雄蕊寬不存在顯著性差異；常見甜柿雄株資源間花托寬不存在顯著性差異；常見澀柿雄株資源間雄蕊數不存在顯著性差異；富有F1資源間雄蕊寬不存在顯著性差異。除此之外，各指標間均存在顯著性或極顯著性差異，說明各類型資源內部單株間雄花表型存在豐富的變異。

2.3 不同來源地和類型間資源的雄花表型指標比較

比較10個類型間柿雄性種質雄花表型之間的差異程度，結果如表4所示，除雄蕊數和萼片數量不存在顯著差異外，其余11個指標在不同來源地和類型間均表現出不同程度的差異，其中以萼片寬、花托高和花托寬變異程度最大。廣西雄性資源的花筒直徑、花筒高、最長和最短雄蕊長值均最小，湖北木蘭山野柿雄株的萼片寬、花托高和花托寬值最小；而江西野柿雄株的最短雄蕊長、萼片長、花托高和花托寬值最大，以及常見甜柿雄性資源的花筒直徑、花筒高、最長雄蕊長、萼片寬和花柄長均值最大。此外，江蘇野柿雄株的雄蕊數最多，最高達19枚/朵；羅田野柿雄株的花柄最粗，‘富有’ב赤柿’雜交F1代雄株的雄蕊寬值最大。

2.4 各類型資源雄花表型的主成分分析

對93份雄性資源雄花的13個表型指標進行主成分分析，前4個主成分的累積貢獻率達到77.876%，因此選取前4個主成分作進一步分析。如表5所示，成分1主要代表花筒直徑、花筒高、最短雄蕊長、最長雄蕊長、雄蕊寬；且花筒表型與雄蕊指標呈正相關，即花筒越大、雄蕊也越大。成分2主要代表萼片長、萼片寬、花托高、花托寬；萼片與花托表型也呈正相關。成分3主要代表萼片數量；成分4主要代表雄蕊數。分別選取2個主成分對93份雄性資源進行聚類分析，以判斷各資源雄花表型特征。

表5 旋轉后的成分矩陣Table 5 The component matrix after rotation

以成分1為橫坐標，成分2為縱坐標繪制散點聚類圖，橫坐標的值增加代表花筒直徑、花筒高、最短雄蕊長、最長雄蕊長、雄蕊寬增大；縱坐標的值增加代表萼片長、萼片寬、花托高和花托寬增大。圖2中各資源被分為5類，第Ⅰ類包括江西野柿雄3和江蘇野柿1-19，具有花筒、雄蕊小，但萼片、花托大的特點；第Ⅱ類包括湖北云架山8、江西野柿雄1、江西野柿雄4、太秋、耀縣五花柿和小八胡等，這些資源的花筒和雄蕊較小，萼片和花托較大；第Ⅲ類包括江蘇野柿2-9和47A(4)(甘秋芽變)，這類資源的花筒、雄蕊大，萼片、花托和花柄也較大；第Ⅳ類包含33份資源，表現出花筒和雄蕊、萼片、花托和花柄都較小的共同特點；第Ⅴ類包含50份資源，這些資源的花筒、雄蕊較大，但萼片、花托較小。

圖中編號對應資源名稱詳見表1，下同。The number corresponding to the resource in the figure is shown in Table 1. The same below.圖2 93份雄性種質資源以成分1和2為坐標的散點聚類圖Fig.2 Scatter plot of 93 male germplasm resources with components 1 and 2 as coordinates

以成分1為橫坐標，成分4為縱坐標繪制散點聚類圖，橫坐標的值增加代表花筒直徑、花筒高、最短雄蕊長、最長雄蕊長、雄蕊寬增大；縱坐標的值增加代表雄蕊數減少。由圖3可知，93份雄性資源被分為6類，其中第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類資源的雄蕊數都較低；第Ⅰ類資源的花筒和雄蕊最小，而第Ⅲ類資源花筒和雄蕊最大；第Ⅳ和Ⅴ類資源的花筒、雄蕊大小分別與第Ⅰ和Ⅱ類資源相似，而雄蕊數較多；第Ⅵ類資源包括廣西51和油柿，其花筒、雄蕊小于其他資源，但其雄蕊數最多。

圖3 93份雄性種質資源以成分1和4為坐標的散點聚類圖Fig.3 Scatter plot of 93 male germplasm resources with components 1 and 4 as coordinates

以成分3為橫坐標，成分2為縱坐標繪制散點聚類圖，橫坐標的值增加代表萼片數量增加；縱坐標的值增加代表萼片長和寬、花托高和寬增大。由圖4可知，93份資源被分為4類，其中第Ⅰ類資源包括江西野柿雄3、江蘇野柿1-19、47A(4)(甘秋芽變)和耀縣五花柿，這些資源萼片數量較少，但萼片長和寬、花托高和寬最大；第Ⅱ類資源包括86份，都表現出萼片數較少，萼片長和寬、花托高和寬也較小的特點；第Ⅲ類資源為湖北木蘭山24，其萼片數量偶有5瓣，萼片長和寬、花托高和寬都很小；第Ⅳ類資源包括廣西51和廣西2，其萼片數量偶有5瓣或6瓣。

圖4 93份雄性種質資源以成分3和2為坐標的散點聚類圖Fig.4 Scatter plot of 93 male germplasm resources with components 3 and 2 as coordinates

2.5 花粉表型變異

對29份柿種內雄性資源及其4個近緣種的花粉進行電鏡觀察，觀察各雄性種質花粉形態、粒表面紋飾及萌發溝(圖5)，并測量花粉長、寬及其表面條紋長度。結果表明，5個種間資源的花粉長和寬均存在極顯著性差異(P<0.01)，表面條紋長存在顯著性差異(P<0.05)。由表6可知，美洲柿花粉最大，其次為柿，兩者的花粉長和花粉寬顯著高于君遷子、浙江柿和油柿，而后三者之間差異不顯著。此外，油柿的花粉表面條狀紋飾最長，浙江柿最短。

圖5 部分柿及其近緣種花粉電鏡觀察圖Fig.5 Electron microscopic observation of the pollen of some persimmon and its related species

表6 柿及其近緣種間花粉形態指標比較Table 6 Comparison of pollen morphology between persimmon and its interrelated species μm

柿種內29份資源間花粉長存在顯著性差異(P<0.05)， 云架山5號和老尖山5號資源的花粉最長，羅田野柿雄株的花粉最短。花粉寬和表面條紋長在29份資源間均存在極顯著性差異(P<0.01)，Tukey’s多重比較發現木蘭山43花粉顯著寬于木蘭山11、耀縣五花柿和青化雄株；木蘭山1號和江蘇野柿2號的花粉表面紋最長，華柿1-1最短，變異系數為28.93%，說明花粉表面條紋長度在29份柿雄性資源間存在豐富的變異(表7)。此外，對花粉長、寬和表面條紋長進行Pearson相關性分析，結果表明花粉長和花粉寬之間的相關系數為0.767，呈極顯著性正相關(P<0.01)。

表7 柿種內29份雄性資源花粉形態指標比較Table 7 Comparison of pollen morphology between 29 male resources in persimmon μm

表7(續)

此外，經掃描電鏡顯微觀察，柿及其近緣種的花粉表面結構均呈線性條紋狀，除條紋的長短在各資源間存在顯著性差異外，各資源花粉表面條紋的深淺和交錯程度也存在差異。條紋較淺的資源有11份，包括木蘭山16號、木蘭山44號、江蘇野柿1號、正月、平頂山澀柿、什樣柿、興義水柿、青化雄株、君遷子、浙江柿和油柿，剩余22份資源花粉表面條紋較深。條紋交錯程度低、方向較為一致的資源有6份，即木蘭山1號、木蘭山7號、木蘭山16號、木蘭山44號、江蘇野柿1號和正月；剩余27份資源花粉表面條紋縱橫交錯程度較高。此外，柿及其近緣種的花粉萌發溝內呈現出顆粒狀凸起，各凸起的直徑為0.3～0.6 μm。

3 討 論

3.1 柿及其近緣種間雄花表型及花粉微觀形態多樣性

本研究對比了柿與其4個近緣種間雄性種質的雄花表型差異，在13個表型指標中，只有5個指標在種間有顯著差異，說明柿屬植物種間雄性資源表型變異程度較弱。就花粉粒大小而言，美洲柿最大，其次為柿，而君遷子、浙江柿、油柿較小；由于美洲柿與柿均為六倍體，而君遷子、浙江柿、油柿為二倍體，所以呈現出花粉體積隨著倍性增加而增加的規律，這與張永芳[12]的報道一致。

3.2 柿種內雄花表型及花粉微觀形態多樣性

本研究發現柿種內不同來源地和類型間雄性資源的雄花表型變異程度較強，13個表型指標中，除雄蕊數和萼片數量在柿種內10個類別間不存在顯著差異外，其余11個指標均表現出不同程度的差異，其中萼片寬、花托高和花托寬等指標的變異程度最大；常見甜柿雄性資源在多個表型指標中均表現出優于其他類型資源的特點，這可能與長期的人為選擇有關。此外，柿種內10個類別內部資源雄花表型也存在較強變異，尤其是云架山野生雄性資源，其13個表型指標在不同單株間均存在極顯著差異；木蘭山野生雄性資源除雄蕊寬和萼片數量外，其余指標在不同單株間也均存在極顯著差異，這與王麗媛等[9]發現的湖北木蘭山和云架山來源的雄性資源遺傳多樣性最高一致。但是，湖南野柿雄性資源在花筒直徑、雄蕊數、最長雄蕊長、萼片長、花托高和花柄粗等6個指標中無顯著差異，羅田野柿雄性資源也有4個指標無顯著差異，推測可能與這2個類別的樣本數量較少有關。

3.3 柿雄性種質資源的評價與鑒定

對于收集保存的種質資源進行評價和鑒定，是對種質資源充分利用的基礎。表型是生物遺傳變異的表征，植物居群的表型特征與其生境密切相關，其多樣性水平是遺傳多樣性與環境異質性的綜合體現，在適應和進化上具有重要意義[15]。因此，對植物表型形態特征進行評價和鑒定，是種質資源評價的基本而必要的內容。柿作為一種栽培歷史悠久的經濟林樹種，長期以來，人們對柿果實的追求嚴重影響了柿雄性種質的生存與利用，從事柿育種的研究者曾認為柿嚴重缺乏雄性資源，故而目前頒布的《柿種質資源描述規范和數據標準》[13]和《柿新品種特異性、一致性和穩定性測試指南》(2010)2項標準中均缺乏關于柿雄性資源，尤其是雄花表型的相關描述。本研究對收集保存的柿及其近緣種雄性種質資源雄花表型和遺傳變異進行了綜合評價，填補了2項標準的空白，為后續柿雄性種質資源的高效利用，以及柿雄性新品種的選育提供了理論依據。