綿羊Izumo1基因多態性及其與產羔數關聯分析

胡文萍 董新龍,2 田志龍 湯繼順,3 劉秋月 王翔宇 狄 冉 張效生 張金龍 王金玉 儲明星*

(1.中國農業科學院 北京畜牧獸醫研究所/農業農村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193； 2.揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009； 3.安徽省農業科學院 畜牧獸醫研究所，合肥 230031； 4.天津市畜牧獸醫研究所，天津 300381)

動物受精的成敗決定種群能否在自然界穩定存在。哺乳動物受精過程中主要經歷了精子獲能、穿越放射冠、識別卵子透明帶、發生頂體反應、精卵粘附與融合、卵母細胞第二極體排出、兩性原核的融合等步驟[1-2]。早期研究表明致育蛋白(Fertilin)存在于精子質膜上，是一種在精子-卵質膜粘附中起作用的精子表面蛋白，并可能參與受精卵融合[3-6]。致育蛋白由Fertilin α和Fertilin β 2 個亞基組成：敲除Fertilin α基因的雄性小鼠仍能生育[7]；敲除Fertilinβ基因小鼠表現出雄性不育，主要原因不是質膜融合失敗，而是精子無法與透明帶粘附且從子宮向輸卵管的遷移發生障礙[8]。

Inoue等[9]發現精子表面蛋白Izumo1 (Izumo sperm-egg fusion 1, Izumo1)與精卵結合相關。已有研究發現：卵子表面的Juno蛋白是Izumo1在卵子表面的受體[10]；Izumo1和Juno的相互作用是精卵質膜融合所必須，Izumo1和Juno也是目前發現的精子和卵子質膜上的第一個配體-受體蛋白對。Izumo 是免疫球蛋白超家族(Immunoglobulin superfamily, IgSF)的成員[11-12]。而Izumo1是Izumo基因家族的成員之一，Izumo基因家族有4 個成員，分別為Izumo1、Izumo2、Izumo3和Izumo4，擁有同源的N端結構域，“Izumo結構域”。Izumo1～3是跨膜蛋白，均在睪丸上特異性表達。Izumo1也在人[14]、小鼠[9]、豬[1]、綿羊[15]等哺乳動物受精過程中表達。Izumo4是可溶性蛋白，在包括睪丸的多種組織中表達[9,13]。Izumo1的細胞外結構域中有1 個免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)結構域，并在成熟精子的頂層上表達，頂體反應之后，Ig結構域在精子表面暴露。Izumo1的Ig結構域上存在1 個潛在的糖基化位點，在C-末端還有1 個跨膜結構域和1 個短的胞質內尾巴，屬I型膜蛋白。

NCBI上公布的特克賽爾羊Izumo1基因位于第14 號染色體上，其DNA全長3 326 bp，擁有8 個外顯子和7 個內含子，編碼320 個氨基酸。Izumo1基因編碼的蛋白質位于精子質膜內部，在精子上特異性表達[14]。在頂體反應發生時，Izumo1蛋白會從精子頭部前端重新定位到發生融合的位點，包括整個精子頭部和精子赤道部位，使得在頂體反應后暴露在精子頭部的膜外。通過Izumo1的抗體抑制試驗能夠明顯地抑制精卵間的結合和融合過程[1,9,11]，將Izumo肽段直接注射到體內可以造成雌性小鼠免疫性不孕[16]。Izumo基因雙敲除的雌性小鼠具有正常生育能力，但是雄性小鼠雖然能夠正常生長、產生精子和進行交配，卻無法產生后代。通過體外受精試驗發現，Izumo1-/-雄性小鼠的精子雖然可以與去透明帶卵母細胞正常結合，但不能繼續融合而是積留在質膜外側的卵周隙中無法完成受精過程。將Izumo缺陷型精子注射到野生型卵母細胞中，能正常的產生子代，且其子代擁有正常的生育能力。人類精子也含有Izumo，添加抗人類Izumo的多克隆抗體能使精子無法與去透明帶的倉鼠卵融合[9]。這些結果均表明Izumo1參與介導并影響精卵融合過程。

目前，對于Izumo1基因的研究多在哺乳動物精卵融合方面。牛[17]、豬[1]、內蒙古白絨山羊[14,18]、綿羊(品種未知)[14,18]和斑馬魚[19]的Izumo1基因被成功克隆。內蒙古白絨山羊、綿羊(品種未知)2者的Izumo1基因同源性高達99.9%，并與牛、鼠和人Izumo1基因高度同源[18]。然而，Izumo1基因在各個物種中的多態性以及與產生子代數目的相關性研究，特別是有關多羔和常年發情的高繁殖力綿羊小尾寒羊[20-21]Izumo1基因的克隆，多態性檢測及與產羔數的關聯研究尚未見報道。本課題組前期對來自10 個綿羊品種的99 個個體進行了全基因組重測序，獲得了大量的基因多態性數據。為研究Izumo1基因的多態性及與產羔數的關系，本研究擬利用PCR和直接測序法對小尾寒羊和蘇尼特羊Izumo1基因DNA進行擴增和測序，并與本課題組前期綿羊重測序數據比對，在多羔和單羔綿羊群體中篩選出SNP位點，并采用Sequenom MassARRAY?技術進行Izumo1基因分型，研究其SNP位點的各種基因型在各群體中的分布，以期獲得與繁殖相關的候選SNPs位點，為綿羊遺傳育種研究提供新的分子標記。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

選擇760 只年齡在3 歲左右的經產綿羊，包括：有產羔數記錄的多羔品種小尾寒羊380 只；5 個單羔品種共計380 只(單羔品種分別是蘇尼特羊100 只，灘羊80 只，薩福克羊39 只，杜泊羊30 只，草原型藏羊131 只)。其中：小尾寒羊來自山東省鄆城縣誠聯小尾寒羊種羊場和山東省章丘市晟益牧業有限公司，蘇尼特羊來自內蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗民羊牧業有限責任公司，灘羊來自寧夏鹽池縣寧夏朔牧鹽池灘羊繁育有限公司，薩福克、杜泊羊來自北京市順義區北京奧鑫牧業有限公司；草原型藏羊來自西藏當雄縣。對所有綿羊進行頸靜脈采血，每只綿羊分別采血10 mL，經EDTA抗凝處理后4 ℃保存備用。

2×TaqPCR Master Mix(MT201-01)購自北京博邁德；TaKaRa LATaq?with GC Buffer (RR02AG)、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 (9762)、E.coliDH5α Competent Cells (9057)、pMDTMe18-T Vector Cloning Kit (6011)均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 DNA提取及檢測

參照血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)說明書提取DNA。用Nanodrop 2000檢測DNA的純度和濃度，1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.3 引物設計與合成

根據綿羊Izumo1基因全基因組序列(GenBank登錄號為：NC_019471.2)，采用Primer Premier 5.0軟件設計Izumo1基因DNA序列擴增引物。Izumo1基因DNA序列較長，為了方便測序和提高測序準確度，故分段設計4 對擴增引物，分別是P1、P2、P3和P4。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。引物序列、擴增片段大小及退火溫度見表1。

1.4 DNA序列擴增

以提取的血液基因組DNA為模板，用上、下游分段引物擴增目的基因DNA序列。

使用TaKaRa公司高保真LATaq酶體系進行PCR擴增，具體反應體系如下：0.25 μL TaKaRa LATaq(5 U/μL)，10 μL 2× GC Buffer I (5 mmol/L Mg2+Plus)，3 μL dNTP Mixture (各2.5 mmol/L)，4.25 μL RNase-free ddH20，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，1.5 μL血液DNA模板，總計20 μL反應體系。

1.4.2PCR反應程序

Izumo1基因：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，Ta退火溫度退火1 min，72 ℃延伸2 min，35 個循環；72 ℃延伸8 min。反應結束后，PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測所得片段大小，將陽性擴增產物送上海生工生物工程有限公司克隆測序。

1.5 SNP位點篩選

DNAMAN軟件進行多重比對和分析目的基因DNA序列，并結合Chromas軟件中的峰圖判斷和本課題組前期重測序數據，以同一位點不同堿基出現比例>30%認定為SNP位點。初步篩選得到SNP位點，鑒定同義突變和非同義突變。

表1 綿羊Izumo1基因DNA擴增引物Table 1 Primers used for amplifying DNA of Izumo1 gene in sheep

1.6 基因分型

對篩選獲得的目的基因SNP位點，通過Sequenom MassARRAY?(Sequenom iPLEXTMassay, San Diego, CA)基因分型系統對小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、薩福克羊、杜泊羊和草原型藏羊血液DNA樣品進行SNP分型，試驗步驟按照儀器操作指南進行。試驗由北京君諾德生物技術有限公司完成。

1.7 統計分析

用Popgene 32(version 3.2)軟件和PIC-CALC程序對獲得的SNP位點分型結果進行處理，計算其雜合度He(Heterozygosity)、多態信息含量PIC(Polymorphism information content)等。采用SPSS 18.0軟件卡方檢驗對2 個品種的各SNPs位點基因型頻率和基因頻率進行差異顯著性檢驗，并與產羔數進行相關性分析。相關性分析模型為：

yijkl=μ+Genotypei+Pj+Sk+eijkl

式中：yijkl為性狀觀察值；μ為總體均數；Genotypei為基因型效應；Pj為胎次效應；Sk為場次效應；eijkl為隨機誤差。假定eijkl相互獨立，服從N(0，σ2)分布。

2 結果與分析

2.1 血液DNA檢測結果

利用NanoDrop 2000超微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測小尾寒羊和蘇尼特羊組織DNA的純度、濃度和完整性。檢測結果發現，D260nm/D280nm比值都在1.8～2.0范圍內，濃度均在30 ng/μL 以上，電泳條帶合格，可用于后續試驗。

2.2 DNA序列擴增結果

凝膠電泳結果顯示PCR擴增的DNA片段條帶明亮且單一，大小與設計一致，說明擴增結果良好(圖1)。使用DNAMAN軟件對測序得到的DNA片段進行序列拼接，成功得到2 種綿羊Izumo1基因完整DNA序列。特克賽爾羊Izumo1基因DNA全長序列為3 326 bp，本試驗擴增得到的小尾寒羊Izumo1基因DNA全長序列3 385 bp，蘇尼特羊Izumo1基因DNA全長序列3 382 bp。BLAST結果顯示二者與特克賽爾羊Izumo1基因DNA序列的相似性都高于95%。與NCBI數據庫中提供的特克塞爾羊Izumo1基因DNA序列相比：在Izumo1基因DNA序列605 bp位置，小尾寒羊和蘇尼特羊分別多出了57和55 bp的序列(57 bp: ACCCCCCACCCCCCCCGCGCAGATGAGGCCA-CACTGGAAAAGGCATCCTGGAGTTTG；55 bp: ACCCCCCACCCCCCGCGCAGATGAGGCCACA-CTGGAAAAGGCATCCTGGAGTTTG)。

M：DL2 000 DNA分子量標記； P1～ P4：綿羊Izumo1基因DNA擴增引物。
M, DL2 000 DNA marker； P1-P4, primers used for amplifying DNA ofIzumo1gene in sheep.
圖1Izumo1基因序列分段擴增產物電泳圖
Fig.1 Electrophoresis of segmental amplification products ofIzumo1gene

2.3 SNP位點篩選結果分析

用4 對引物分別對小尾寒羊和蘇尼特羊的60 個樣品進行目的基因序列的SNP位點篩選，對PCR擴增特異性好的單一條帶進行雙向測序，測序峰圖清晰可辨的位點用于SNP統計共獲得了5 個SNP位點(g.54409483A>G，g.54410565A>G，g.54411606C>A，g.54411750T>C，g.54411792A>G)(圖2)。另外結合本課題組前期對10 個綿羊品種的99 個個體進行的全基因組重測序數據，篩選得到Izumo1基因的另外3 個SNP突變位點(g.54409033T>A， g.54412107C>A，g.54412135A>G)。共篩選得到8 個潛在的SNPs位點， 6 個位于外顯子區域，均為錯義突變，2 個位于5’UTR。其中A/G轉換的數量最多，共有4 個；T/C 轉換的數量為1 個；C/A顛換2 個；T/A顛換1 個；不存在G/C顛換和G/T顛換。轉換的數量占總檢測到的SNPs位點的62.5%，顛換占37.5%。

圖2 通過擴增獲得的5個Izumo1基因SNP位點
Fig.2 Five SNPs ofIzumo1gene obtained by amplification

2.4 Izumo1基因SNP位點與綿羊產羔性狀關聯分析

根據分型所獲得的數據，對上述8 個位點進行了初步篩選，將在單、多羔綿羊群體中位點分布沒有差異的SNP位點排除，最終篩選獲得的g.54412135A>G和g.54412107C>A 2個位點。通過基因分型發現：Izumo1基因g.54412135A>G位點在多羔和單羔綿羊品種中存在GG、GA和AA 3種基因型，g.54412107C>A在多羔品種中存在CC和CA 2 種基因型，而在單羔品種中存在CC、CA和AA 3種基因型(表2)。g.54412135A>G位點在小尾寒羊、灘羊和草原型藏羊品種中存在GG、GA和AA 3種基因型，而在蘇尼特羊中存在GG和GA 2種基因型，在薩福克羊和杜泊羊中僅有GG 1種基因型；g.54412107C>A在小尾寒羊、蘇尼特羊、薩福克羊和草原型藏羊品種中存在CC和CA 2種基因型，而在灘羊和杜泊羊品種中存在CC、CA和AA 3種基因型(表3)。Izumo1基因的g.54412107C>A位點的基因型頻率和基因頻率在單、多羔綿羊群體間的分布差異均極顯著(P<0.01)。

利用Popgen 32軟件統計分析綿羊Izumo1基因2 個品種各SNP位點的多態性。由表3可知，在6 個品種中的g.54412135A>G多態位點多態信息含量(PIC)都屬于低度多態(PIC<0.25)；杜泊羊的g.54412107C>A多態位點屬于中度多態(0.25G多態位點處于哈代溫伯格平衡，6 個綿羊品種的 g.54412107C>A多態位點，均處于哈代溫伯格平衡。

表2 在單、多羔綿羊品種Izumo1基因2 個位點的基因型頻率和等位基因頻率分析Table 2 Genotype and allele frequencies of two SNPs of Izumo1 gene in monotocous and polytocous sheep

注：P<0.01表示差異極顯著。

Note:P<0.01 indicates extremely significant difference.

表3 6個綿羊品種中Izumo1基因的2個SNPs位點的群體遺傳學分析Table 3 Genetic polymorphism information of Izumo1 gene two SNPs in six sheep breeds

表3(續)

注：P>0.05表示位點在該品種中處于哈代溫伯格平衡狀態；P<0.05表示位點在該品種中不處于哈代溫伯格平衡狀態。

Note:P>0.05 indicates the locus was under Hardy-Weinberg equilibrium.P<0.05 indicates the locus was not under Hardy-Weinberg equilibrium.

Izumo1基因g.54412135A>G和g.54412107C>A位點的不同基因型與小尾寒羊產羔數的關聯分析統計結果。可看出2 個位點不同基因型與小尾寒羊不同胎次產羔數之間，不存在顯著關聯(P>0.05)(表4)。

表4 Izumo1基因2 個多態位點的不同基因型與小尾寒羊產羔數的關聯分析Table 4 Association of differrent SNP genotypes of the Izumo1 gene with litter size in Small Tail Han sheep

3 討論與結論

基因序列的外顯子區域是相對保守的，因此在外顯子區SNP位點比較少，因此，外顯子出現變異的頻率僅為內含子等區域的1/5[22]。外顯子區域中發生變異的影響遠>內含子區，因為外顯子的變異可能會造成氨基酸的改變，從而改變蛋白質的性質與功能，然而，真核生物的基因表達調控非常復雜，是基因與多種轉錄因子共同參與、相互作用的結果。基因的非翻譯區(UTR)常常參與基因的表達調控。5′UTR常常可以決定轉錄的水平和方式，而 3′UTR 可以調控mRNA的穩定性[23-25]。因此，外顯子區和5′UTR的基因變異常常會直接影響生物性狀，在遺傳育種的研究中意義重大。

自2005 年Inoue等[9]發現Izumo1與精卵結合相關后，其功能和作用機制的研究在哺乳動物中展開，雖有報道陸續克隆了牛[17]、豬[1]、山羊[14,18]、綿羊[14,18]和斑馬魚[19]的Izumo1基因，而對于其單核苷酸多態性關注度并不高，Izumo1基因在各個物種中的多態性與產生子代數目的相關性的研究還未見報道。目前在Ensemble數據庫(http:∥asia.ensembl.org/Ovis_aries/Transcript/ProtVariations?db=core;g=ENSOARG00000012130;)中發布的綿羊(Ovisaries)Izumo1基因的SNPs位點只有7 條記錄。本研究在Izumo1基因DNA序列中篩選到8 個SNPs位點，豐富了綿羊Izumo1基因的單核苷酸多態性。其中，在外顯子區篩選到6 個SNPs位點并均為錯義突變，遺憾的是無法在6 個綿羊品種中進行基因分型，只有2 個處于5′UTR中的位點分型成功。

產羔數是綿羊重要的繁殖性狀，已有研究對其研究主要聚焦在母羊排卵方面，發現了諸如生長分化因子9(GDF9)、骨形態發生蛋白15(BMP15)和骨形態發生蛋白受體IB(BMPR1B)等高繁殖力主效基因[26-30]，尤其是顯著影響小尾寒羊排卵數的BMPR1B基因FecB突變[31]。精子Izumo1蛋白，作為一種跨膜蛋白，主要對哺乳動物受精過程中的精卵融合具有重要作用[9]，能夠通過與卵子的識別和融合影響受精過程，猜測其可能對于綿羊繁殖也至關重要[14]。Inoue等[9]利用重組Izumo蛋白制備的多克隆抗體進行免疫標識，發現小鼠Izumo蛋白大小為56.4 ku，僅在睪丸組織中表達。Kim等[1]研究證實Izumo1蛋白位于精子質膜內部，在精子上特異性表達，只在精卵融合時才會在精子頭部檢測到。本研究只對小尾寒羊母羊進行了產羔數的關聯分析，發現Izumo1基因的2 個多態性位點與小尾寒羊母羊不同胎次產羔數之間不存在顯著關聯。推測Izumo1基因可能在母羊個體本身并沒有重要的生物學作用，與母羊的產羔數性狀并不相關。在其他物種中，Izumo1是否與產生子代數量相關有待進一步研究。Izumo1作為精卵質膜融合的關鍵性配體蛋白，直接決定了精子是否能夠正常與卵子發生融合，推測Izumo1基因可能與公羊的繁殖力性狀有關。本研究克隆了完整的小尾寒羊和蘇尼特羊的Izumo1基因，并在Izumo1基因中獲得了8 個SNPs位點。其中：Izumo1基因的g.54412107C>A位點基因型頻率和等位基因頻率在單、多羔綿羊群體間的分布差異均極顯著。Izumo1基因g.54412135A>G和g.54412107C>A位點的不同基因型和小尾寒羊不同胎次的產羔數之間沒有顯著關聯(P>0.05)。