捻轉血矛線蟲GST耐藥基因的克隆、表達及生物信息學分析

趙學亮 孫 柯 蘇 倩 呼和巴特爾 王文龍

(內蒙古農業大學 獸醫學院/農業農村部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，呼和浩特 010018)

捻轉血矛線蟲(Haemonchuscontortus)是毛圓科血矛屬的一種消化道線蟲，主要寄生在綿羊、山羊、牛等反芻動物的皺胃，偶見于小腸[1]。該病分布廣泛，給畜牧業，尤其是熱帶、亞熱帶及降雨量較多的地區養殖業帶來嚴重威脅[2]。國內外對捻轉血矛線蟲病主要采用丙硫咪唑等化學藥物防治，然而隨著該類驅蟲藥物的使用，捻轉血矛線蟲的耐藥現象逐漸凸顯。van Wyk等[3]于1986年首次報道捻轉血矛線蟲對丙硫咪唑等驅蟲藥物的耐藥性。隨后的幾十年內，捻轉血矛線蟲耐藥性已在世界范圍內廣泛得到報道[4]。因此，在捻轉血矛線蟲耐藥檢測方法和耐藥機制研究顯得尤為重要。

丙硫咪唑能與捻轉血矛線蟲β-微管蛋白亞基結合，阻斷β-微管組裝，使蟲體發育代謝障礙，從而導致蟲體死亡。據報道捻轉血矛線蟲對丙硫咪唑產生耐藥性的主要原因是由于β-微管蛋白同種型Ⅰ基因的突變(F167Y，E198A和F200Y)，導致該蛋白結構改變，使藥物不能與其靶位點結合而失去作用[5]。但由于寄生蟲等真核生物復雜的耐藥機制，耐藥性的產生可能存在多種原因[6]，耐藥機制尚待進一步研究。

谷胱甘肽S轉移酶(Glutathione S-transferase，GST)于20世紀60年代在大鼠肝臟中首次被發現，是生物體內最重要的解毒酶系之一。GST能催化親電性有害物質與還原型谷胱甘肽結合發揮解毒功能，對生物體代謝內源性和外源性化合物起著重要作用[7]。而GST在寄生蟲耐藥性、細菌耐藥性都發揮著主導作用[8-9]。因此本試驗基于轉錄組測序分析的基礎上，擬篩選出與耐藥相關的GST基因[10]。通過對捻轉血矛線蟲GST蛋白結構序列、抗原表位進行預測分析，探究原核表達系統最佳誘導表達條件，以期獲得穩定的純化GST重組蛋白，為探究捻轉血矛線蟲耐藥機制和免疫防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 蟲株及質粒

捻轉血矛線蟲丙硫咪唑敏感株(HC)和耐藥株(HC-BZ)均在液氮中保存，用于RNA的提取。克隆載體pMD19-T simple vector，購自大連寶生物工程有限公司；表達載體pET30a(+)在本實驗室保存。

1.2 試劑及儀器

Trizol試劑、反轉錄試劑盒、限制性內切酶EcoR Ⅰ、XhoⅠ等均購自TaKaRa公司；質粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；Ni+蛋白純化試劑盒購自上海生工；氯仿、異丙醇均為國產分析純。核酸濃度測定儀(Thermo NanoDrop 2000，美國)、凝膠影像儀(賽智創業科技有限公司，北京)。

1.3 Total RNA提取及cDNA合成

將組織樣品在液氮中取出，放入預冷的研缽中研磨，然后加入Trizol，提取捻轉血矛線蟲總RNA。將獲得的總RNA進行濃度、純度檢測后，利用反轉錄試劑盒合成cDNA。

1.4 GST基因擴增

1.5 GST基因克隆及測序

用膠回收試劑盒回收PCR產物，將目的片段3’末端添加“A尾”，然后與克隆載體pMD19-T過夜連接，轉化至Trans1-T1感受態細胞中，過夜培養。將陽性菌株送華大基因公司進行測序，測序結果正確的質粒命名為pMD19T-GST。

1.6 GST基因原核表達載體構建

將pMD19T-GST和表達載體pET30a(+)分別用限制酶EcoR Ⅰ和XhoⅠ進行雙酶切，回收目的基因和載體片段，T4連接酶過夜連接，轉化至E.coliDH5α感受態細胞，過夜培養后進行PCR和雙酶切鑒定，陽性菌株送華大基因公司進行雙向測序，測序結果正確的質粒命名為pET30a(+)-GST。

1.7 GST蛋白表達條件優化

將測序正確的重組表達菌BL21(pETGST)接種于10 mL含Kan抗性的LB液體培養基中，37 ℃過夜培養，對重組表達菌BL21(pETGST)進行溫度、時間和IPTG誘導濃度表達條件優化。溫度優化，將溫度分為20、25、30和37 ℃不同梯度，在搖床中180 r/min培養6 h。時間優化，分別在0、1、2、3、4、6、7、8和9 h時間點各取2 mL菌液，37 ℃，180 r/min 培養。IPTG濃度優化，濃度梯度分別為0.05、0.1、0.2、0.6、1.0、2.0和4.0 mmol/L，37 ℃，180 r/min培養6 h。離心收菌，按照不同的OD值加入相應量的PBS，然后加入蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min裂解變性，用12% SDS-PAGE凝膠電泳檢測。

1.8 重組蛋白表達形式鑒定

按照最佳誘導條件分別誘導100 mL重組表達菌液，低溫超速離心收集菌液沉淀，然后超聲破碎，12 000 r/min低溫離心15 min，分別收集上清和沉淀，煮沸10 min裂解變性，用12% SDS-PAGE凝膠電泳進行表達形式檢測。

1.9 重組表達菌pET30a-GST的純化

按照1.8方法收集上清和沉淀，并利用8 M尿素充分溶解沉淀，然后離心收集上清，用0.45 μm孔徑的濾器過濾，然后按照上海生工Ni+說明書純化蛋白。

1.10 GST基因生物信息分析

利用蛋白質在線分析工具Prot-Param(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析GST蛋白質的理化性質(氨基酸組成，分子質量，不穩定系數、等電點等)；利用ProtScale(https:∥web.expasy.org/protscale/)分析GST蛋白的親水性和疏水性[11]；利用SignalP 4.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)預測GST蛋白的信號肽[12]；利用TMHMM Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測GST蛋白的跨膜區[13]；利用NetPhos3.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測GST蛋白的磷酸化位點[14]；利用在線軟件SOPMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測GST蛋白的二級結構[15]；利用在線軟件SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)預測GST蛋白的三級結構[16]；利用Conserved domains(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對GST蛋白進行保守結構域預測分析[17]；利用DNAStar分析GST蛋白B細胞抗原表位等。

2 結果與分析

2.1 GST基因擴增、克隆及測序

PCR擴增捻轉血矛線蟲GST基因，經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示在618 bp處擴增出條帶，片段長度與預期片段大小一致(圖1)。

M，DNA 標準DL2000；1～3，GST基因的擴增產物。
M， DL2000 DNA Marker； 1-3， products ofGSTgene.
圖1 捻轉血矛線蟲GST基因PCR擴增結果
Fig.1 PCR amplification results ofGSTgene ofHaemonchuscontortus

2.2 重組表達載體的構建與鑒定

將測序正確的菌液提取質粒，限制性內切酶XhoⅠ和EcoR Ⅰ進行雙酶切，結果顯示，分別出現在大小為618 bp和5 422 bp的條帶，表明目的片段插入到表達載體pET30a中，成功構建重組質粒(圖2)。

M，DNA標準DL5000；1～2，pET30-GST的雙酶切產物。
M， DL5000 DNA Marker； 1-2， double restriction enzyme digestion products of pET30-GST.
圖2 重組質粒pET30-GST的雙酶切鑒定
Fig.2 Identification result of recombinant plasmid pET30a (+)-GST byXhoⅠ andEcoR Ⅰ digestion

2.3 重組蛋白表達條件優化

對重組表達菌BL21(pETGST)進行誘導表達溫度、時間和IPTG濃度優化，結果顯示，4個不同溫度下誘導后的重組表達菌均在29 ku誘導出條帶，在37 ℃時的蛋白表達量最高(圖3)。9個不同時間下誘導后的重組表達菌均在29 ku誘導出條帶，表達量隨著誘導時間的增加而增加，在6 h時表達量達到最高(圖4)。7 個不同IPTG濃度優化梯度下誘導后的重組表達菌均在29 ku誘導出條帶，但表達量和OD600 nm值均沒有顯著差異，表明IPTG濃度對重組表達菌影響較小，所以選擇IPTG終濃度0.05 mmol/L為IPTG的最佳誘導濃度(圖5)。至此，成功對重組蛋白表達條件進行優化，最佳誘導條件為37 ℃、6 h、IPTG濃度0.05 mmol/L。

M1，protein maker (10～180 ku)；M2，protein maker (14.3～97.2 ku)；1，BL21 (DE3)對照；2，誘導后pET30；3，誘導前pET30；4～7，BL21 (pETGST) 20，25，30和37 ℃誘導表達。
M1, protein maker (10-180 ku); M2, protein maker (14.3-97.2 ku); 1, BL21(DE3); 2, pET30 after induction; 3, pET30 before induction; 4-7, BL21 (pETGST) induced expression at 20, 25, 30 and 37 ℃, respectively.
圖3 重組基因BL21(pETGST)誘導溫度優化結果
Fig.3 Expression of recombinant gene BL21 (pETGST) under different temperatures by SDS-PAGE

M1，protein maker (10-180 ku)；M2，protein maker (14.3～97.2 ku)；1，BL21(DE3)對照；2，誘導后pET30；3，誘導前pET30；4～13，BL21 (pETGST)在 0，1，2，3，4，5，6，7，8和9 h時的誘導表達 M1, protein maker (10-180 ku); M2, protein maker (14.3-97.2 ku); 1, BL21(DE3); 2, pET30 after induction; 3, pET30 before induction; 4-13. BL21 (pETGST) induced at 0, 1, 2, 3, 4 5, 6, 7, 8 and 9 h, respectively.
圖4 重組基因BL21(pETGST)誘導時間優化結果
Fig.4 Expression of recombinant gene BL21 (pETGST) under different temperatures by SDS-PAGE

M1，protein maker (10～180 ku)；M2，protein maker (14.3～97.2 ku)；1，BL21(DE3)對照；2，誘導后pET30；3，誘導前pET30；4，誘導前BL21(pETGST)；5～11，BL21 (pETGST)在 0.05，0.1，0.2，0.6，1.0，2.0和4.0 mmol/L時的誘導表達。
M1, protein maker (10-180 ku); M2, protein maker (14.3-97.2 ku); 1, BL21(DE3)；2, pET30 after induction；3, pET30 before induction；4, BL21 (pETGST) before induction; 5-11, The expression production of IPTG concentration with 0.05, 0.1, 0.2; 0.6; 1.0, 2.0, 4.0 mmol/L, respectively.
圖5 重組基因BL21(pETGST) IPTG誘導濃度優化結果
Fig.5 Expression of recombinant gene BL21 (pETGST) under different IPTG concentrations

2.4 重組蛋白表達形式鑒定

利用最佳優化條件(37 ℃、6 h、0.05 mmol/L)對重組表達菌進行大量誘導表達，然后經12%的SDS-PAGE凝膠電泳進行表達形式鑒定。結果顯示，重組蛋白rGST以包涵體的形式存在(圖6)。

M1，protein maker(10～180 ku)；1，rGST上清；2，rGST沉淀。
M1, protein maker (10-180 ku); 1,rGST supernatant; 2, rGST precipitation.
圖6 重組蛋白表達形式鑒定
Fig.6 Detection of expression products of recombinant protein

2.5 重組蛋白純化

利用8 mol/L尿素溶解包涵體沉淀，離心后收集上清，然后用0.45 μm濾器過濾后與Ni+柱過夜結合，根據蛋白純化說明書獲得較純的蛋白。經SDS-PAGE結果顯示，目的蛋白條帶大小約為29 ku，與預期大小一致(圖7)。

M1，protein maker (10～180 ku)；M2，protein maker (14.3～97.2 ku)；1～2，rGST純化。
M1, protein maker (10-180 ku); M2, protein maker (14.3-97.2 ku); 1-2, rGST purification.
圖7 重組蛋白純化結果
Fig.7 Result of recombinant protein purification

2.6 GST基因編碼蛋白的生物信息學分析

利用Port-Param在線軟件分析GST蛋白的一級結構，結果表明，GST基因序列長618 bp，編碼205個氨基酸，分子式為C1083H1657N277O294S6，理論等電點為9.53，包含20種氨基酸，其中含量最高的是Lys占10.2%，含量最低的是Cys占1.0%；蛋白質不穩定指數為34.80，屬于穩定蛋白；脂肪系數為83.32；總平均親水指數為-0.256，是親水性蛋白。親水性預測分析表明，該蛋白在氨基酸第31位點存在最小值-2.51，親水性較強，在氨基酸第136位點存在最大值1.83，疏水性較強。跨膜區和信號肽預測表明該蛋白不含有跨膜區和信號肽。磷酸化位點預測表明，GST蛋白共含有12個磷酸化位點，含有蘇氨酸位點最多，酪氨酸位點最少。二級結構預測顯示，α螺旋含量最多，共有106個，占GST蛋白二級結構的51.71%；β轉角含量最少，共有11個，占GST蛋白二級結構的5.37%(圖8)。SWISS-MODEL三級結構預測顯示，GST蛋白與1zl9.1.A同源性最高，為57.14%，GMQE值為0.81，趨近于1，建模質量較好，表明所得結果可靠(圖9)。結構功能域預測發現，GST蛋白在4～73位氨基酸有一個GST_N_Sigma結構域，是GST同源區結合位點，屬于PTZ00057超家族成員。抗原表位預測顯示，GST蛋白含有較多潛在的B細胞抗原肽表位，主要位于25～48，55～63，92～106，113～124，139～147，170～189，195～205位氨基酸殘基或其附近，提示這些區段含有潛在優勢抗原表位。

h，α-螺旋；e，延伸鏈；t，β-轉角；c，自由卷曲 h, alpha helix； e, extended strand; t, beta turn； c, random coil
圖8 GST蛋白二級結構預測
Fig.8 Secondary structure prediction of GST protein

圖9 GST蛋白三級結構預測
Fig.9 Tertiary structure prediction of GST protein

3 討論與結論

中國是捻轉血矛線蟲的主要流行國家之一。目前，對該病的防治幾乎主要依靠丙硫咪唑、伊維菌素等化學驅蟲藥，但長期重復使用，導致耐藥株不斷出現。本課題組在2017—2019年對內蒙古綿羊捻轉血矛線蟲進行流行病學調查及耐藥性檢測時發現，捻轉血矛線蟲感染率已達到78%～89%，且耐藥現象十分嚴重[10]，給捻轉血矛線蟲病的防治帶來巨大困難。因此，尋找新的藥物靶點和探索耐藥機理對捻轉血矛線蟲的防控及避免耐藥性的產生具有重要意義。本研究基于轉錄組數據篩選出的耐藥基因GST，對其進行原核表達及生物信息學分析，成功的表達了pET30a(+)-GST重組蛋白，并分析了該蛋白的結構和功能。SDS-PAGE分析顯示，rGST在誘導表達后的6 h達到最大表達量，不同溫度對重組表達菌表達量的影響較大，rGST在誘導溫度為37 ℃時達到最大表達量，IPTG誘導顯示，rGST在0.05～4.0 mmol/L誘導下均得到了表達，且表達量無顯著差異，選擇濃度較小的0.05 mmol/L作為IPTG的最佳誘導濃度。另外，該蛋白以包涵體形式表達，利用Ni+柱對其進行純化時發現，200、250和300 mmol/L咪唑均可將GST蛋白洗脫，且純度較高。

隨著后基因組時代的到來，生物信息學技術已成為生命科學領域研究的重要工具之一。分析蛋白質理化性質、預測蛋白質結構及抗原表位，對解析基因的結構、功能及篩選藥物靶點候選分子具有重要的意義。本研究利用在線軟件對GST蛋白進行預測。生物信息學分析表明，GST蛋白具有完整的ORF，編碼360個氨基酸，理論等電點pI為9.53，共3 317個原子，分子式為C1083H1657N277O294S6，屬于穩定的親水性蛋白，親水性蛋白有利于蛋白的高效表達，利于抗原抗體的嵌合。跨膜區和信號肽預測表明，該蛋白不含有跨膜區和信號肽，屬于膜外蛋白，推測該蛋白可能在細胞合成后直接發揮生物學作用。磷酸化位點預測表明，當潛在磷酸化位點的閾值為0.5時，該蛋白含有12個磷酸化位點，其中4個絲氨酸位點，6個蘇氨酸位點，2個酪氨酸位點。二級結構預測表明，α-螺旋是構成二級結構的主要成分。三級結構預測表明，GMQE值為0.81，趨近于1，且具備典型結構。近年來，隨著生物信息學的快速發展，表位疫苗已成為疫苗研究的熱點，因此對抗原表位的預測具有重要的意義。抗原表位預測表明，GST蛋白含有較多的B細胞抗原表位，具有較好的抗原性，與Liu等[18]旋毛蟲GST蛋白上的研究一致。

GST是生物體內一類重要的解毒酶系，在藥物作用下該基因常發揮其解毒功能，保護機體不受外界選擇壓力的傷害。該蛋白在耐藥性中發揮著重要的作用，Sevastos等[19]研究表明，在禾谷鐮刀菌中GST基因介導丙硫咪唑藥物的耐藥；Sayani等[20]研究發現，GST基因在小菜蛾氰戊菊酯耐藥株的表達量是敏感株的9.5倍，證實了伊朗地區小菜蛾對殺蟲劑的抗性機制與GST有關；Kamita[21]等研究發現蚊子對菊酯類藥物的耐藥性增加，與GST基因的表達量上調有關。本研究發現，GST基因在捻轉血矛線蟲也具有類似生物學功能，可能在響應丙硫咪唑選擇壓力過程中發揮著重要作用。對GST功能和結構的深入探討不僅有助于了解蟲體對丙硫咪唑的耐藥機制，也可為捻轉血矛線蟲耐藥性早期檢測提供參考。

本研究成功構建了捻轉血矛線蟲GST基因原核表達系統，并對表達條件進行優化，獲得了GST重組蛋白；結構分析發現，蛋白質無跨膜區和信號肽，α-螺旋是構成二級結構的主要成分；抗原表位預測表明，GST蛋白是一種含有7個較好抗原表位的親水性蛋白。推測GST基因有望用作捻轉血矛線蟲耐藥性診斷抗原和疫苗候選抗原。