宮內缺氧對幼年大鼠海馬CA3區SYN、Jmjd6的表達與學習、記憶能力的影響

徐小潔，余 鴻

（1.南通衛生高等職業技術學校，江蘇 南通 226016；2.西南醫科大學，四川 瀘州 646000）

宮內缺氧是胚胎發育中的常見問題，神經細胞對缺氧極為敏感（尤其在胚胎發育期），致使出生后出現智力障礙、腦性癲癇、癱瘓等嚴重的神經系統疾病。目前，國內外關于宮內缺氧對神經系統的影響機制及腦內一些神經遞質的表達變化報道甚少。因此，探討宮內缺氧對海馬CA3區突觸體素（SYN）和Jmjd6的表達變化及對幼年大鼠學習記憶能力的影響機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

小鼠抗SYN購自美國Millipore公司，兔抗Jmjd6購自Abcam（Hong Kong）Ltd，羊抗小鼠及羊抗兔均購自北京中杉金橋公司，Leica RM2245電動切片機購自德國Leica公司，Morris水迷宮跟蹤系統購自成都泰盟公司，三氣培養箱購自美國REVCO公司。

1.2 實驗動物

選擇健康成年雌性SD大鼠14只（第三軍醫大學滕鑫生物技術有限公司提供），體重230～250 g，分別與健康成年雄性SD大鼠5只（西南醫科大學動物實驗中心提供），體重230～250 g，按1∶1先后合籠飼養配種，以第二日晨發現雌鼠陰栓記為妊娠0 d，取出雌鼠單獨飼養至孕第14 d。將孕鼠隨機分為對照組和缺氧組，分別為6只和8只。

1.3 方法

1.3.1 宮內缺氧 將缺氧組孕鼠自孕第14 d開始，放入設置好（氧濃度130 ml/L，二氧化碳濃度0.3～0.4 ml/L，溫度25℃，相對濕度75%～80%）的智能型三氣培養箱中制作缺氧腦損傷新生鼠模型，當培養箱控制面板上的數值達到與設置值一致時開始記錄缺氧時間，自孕14 d開始每天缺氧2 h，連續5 d（孕期第 14、15、16、17、18 d），對照組不缺氧。兩組孕鼠自然分娩（孕第21 d），產后兩組每窩隨機選取新生鼠兩只飼養至30 d（30日齡）。

1.3.2 Morris水迷宮實驗 對30日齡的幼年大鼠進行11 d的Morris水迷宮實驗。具體實驗方法[1]如下：四象限階段訓練，每個象限時間間隔10 min，若訓練時大鼠下水60 s仍未找到平臺，則引導大鼠到平臺上，使其在平臺上停留10 s，連續訓練5 d，第6 d（35日齡）進行無平臺60 s空間探查測試，記錄在目標象限的探查時間T1。第7 d開始維持4 d的對位訓練，訓練方法同前，僅平臺移至對側象限，第11 d（40日齡）進行60 s無平臺對位探查測試，記錄在目標象限的探查時間T2。實驗室環境不變，保持安靜，實驗者始終處于同一位置，距泳池最近邊緣約60 cm。

1.3.3 幼鼠取材、石蠟切片、免疫組化染色 于Morris水迷宮實驗結束當日取參與實驗的幼年大鼠腦組織，常規石蠟切片（自大鼠大腦前囟向尾側方向2 mm處，經海馬冠狀面切片，切片厚5μm），切片脫蠟至水，行SYN、Jmjd6免疫組化染色。

1.3.4 圖像分析及統計學處理 將各免疫組化染色切片放在網絡版數碼顯微鏡DMBA200下照相，放大400倍。用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司）對圖像進行分析，所有指標觀察面積為800×600像素，取海馬CA3區中的恒定部位對各指標進行分析。比較兩組SYN和Jmjd6陽性細胞的積分光密度（IOD）值。各指標以均數±標準差（±s）表示。同一指標組間比較運用SPSS 13.0統計軟件包處理，采用獨立樣本t檢驗進行統計分析。

2 結果

2.1 Morris水迷宮實驗結果

Morris水迷宮實驗顯示，缺氧組幼年大鼠探查測試時間（T1）和對位探查測試時間（T2）均較對照組短，差異有顯著性（P＜0.05），見表 1。

表1 兩組幼年大鼠Morris水迷宮實驗在目標象限搜索時間比較（±s，s）

表1 兩組幼年大鼠Morris水迷宮實驗在目標象限搜索時間比較（±s，s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 T1 24.38±4.89 18.47±4.41*n T2對照組缺氧組6 8 22.04±5.57 15.38±6.10*t值P值3.354 0.002 2.965 0.006

2.2 兩組幼年大鼠海馬CA3區SYN免疫組化染色結果

陽性物質為棕黃色的點狀或細顆粒狀物，分布密集，且集中在多形層（見圖1、圖2）。圖像分析顯示，缺氧組SYN陽性細胞的IOD值比對照組小（P＜0.05），見表2。

圖1 對照組SYN陽性物質（免疫組化染色法，400×）

圖2 缺氧組SYN陽性物質（免疫組化染色法，400×）

2.3 兩組幼年大鼠海馬CA3區Jmjd6免疫組化染色結果

陽性細胞胞質被染成棕黃色，細胞中央卵圓形或圓形空泡為細胞核；陽性細胞呈區域性分布，主要位于顆粒層（見圖3、圖4）。圖像分析顯示，缺氧組Jmjd6陽性細胞的IOD值比對照組高（P＜0.05），見表 2。

圖3 對照組Jmjd6陽性細胞（免疫組化染色法，400×）

圖4 缺氧組Jmjd6陽性細胞（免疫組化染色法，400×）

表2 SYN和Jmjd6陽性細胞積分光密度值比較

3 討論

3.1 宮內缺氧導致大鼠學習、記憶能力下降

Morris水迷宮實驗由美國科學家Richard GM Morris于1981年創立[1]。目前常用來作為評價動物學習與記憶的模型。這一實驗的基礎是，嚙齒類動物在水中有強烈的逃避水環境的動機，并以最快、最直接的途徑逃離水環境。學會逃避水環境的過程體現動物的學習能力；根據周圍環境進行空間定位，有目的地游往水中安全的地方（平臺），體現動物的空間記憶能力。海馬在工作、學習、記憶過程中發揮重要作用，對缺氧損傷極為敏感[2]。已有報道表明，缺氧能夠損傷大鼠空間記憶能力[3]。本實驗發現，自孕 14 d 開始孕鼠連續缺氧（130 ml/L）5 d（2 h/d）后，幼鼠探查測試和對位探查測試在目標象限的搜索時間均較對照組明顯延長，說明缺氧組幼鼠的學習、記憶能力下降，宮內缺氧降低了大鼠學習、記憶能力。

3.2 突觸體素含量降低導致大鼠學習、記憶能力下降

突觸體素（synaptophysin，SYN）又稱P38，可作為海馬CA3區神經元功能和損傷修復的標示物[4]。突觸體素含量越低，記憶損傷越嚴重[5]。本實驗通過對突觸體素免疫組化染色及其積分光密度檢測，發現缺氧組幼年大鼠海馬CA3區的突觸體素含量明顯少于對照組，IOD值顯著低于對照組。說明缺氧導致突觸體素含量降低，進而導致大鼠學習、記憶能力降低。

3.3 Jmjd6功能減弱導致大鼠學習、記憶能力下降

Takeuchi等[6]于1995年發現Jumonji基因，該基因是小鼠神經管形成的必需基因，其編碼產物Jmj蛋白質含有DNA結合結構域（AT-rich interactiondomain，ARID）和兩種保守的 Jmj結構域（JmjN、JmjC）。Jmjd6（Jumonji C domain containing gene 6）屬加雙氧酶，且是一種組蛋白精氨酸去甲基酶[7]。JmjC結構域可以使精氨酸上的甲基羥基化而去掉甲基[8]，這需要氧的參與。在宮內缺氧條件下，JmjC結構域不能發揮正常活性或活性很弱。Jmjd6的加雙氧酶功能和組蛋白精氨酸的去甲基化功能就不能正常發揮或功能很弱，可以通過以下途徑影響宮內缺氧幼年大鼠的學習、記憶能力：第一，Jmjd6可以調節細胞的分化和增殖，異常調節可以影響細胞的成熟以及導致腫瘤[9]，缺氧使Jmjd6的功能不能正常發揮，從而導致功能不正常的神經元不斷分化、增殖，造成智力低下；第二，不能正常發揮作用的Jmjd6通過改變基因的表達和調節血管內皮生長因子受體1（Flt1）而影響血管內皮細胞的再生功能[10]。所以，缺氧導致的Jmjd6不能正常發揮作用而抑制血管生成，在本實驗中表現為缺氧組幼年大鼠大腦中的血管數量減少，腦供血相對不足進而出現智力低下。這與本次Morris水迷宮實驗中缺氧組幼年大鼠探查測試和對位探查測試在目標象限的搜索時間均較對照組短的結果一致。本研究對Jmjd6進行了免疫組化染色及積分光密度檢測，發現缺氧組幼年大鼠海馬CA3區Jmjd6含量明顯高于對照組，說明宮內缺氧可能導致Jmjd6功能不能正常發揮或功能減弱進而造成海馬CA3區功能不正常的神經元數量增多，從而降低了大鼠的學習、記憶能力。