成釉細(xì)胞微環(huán)境對(duì)胚胎干細(xì)胞特性的影響

寧 芳

胚胎干細(xì)胞具有自我更新和多向分化能力，已有研究證實(shí)在適當(dāng)?shù)臈l件下胚胎干細(xì)胞可以向骨、軟骨、心肌、神經(jīng)、脂肪等不同胚層的組織分化[1-8]。這些誘導(dǎo)分化是建立在特定的誘導(dǎo)因子或者條件培養(yǎng)基的誘導(dǎo)條件上的[9-13]。有學(xué)者研究，胚胎干細(xì)胞經(jīng)神經(jīng)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后可向神經(jīng)組織方向轉(zhuǎn)化，而經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后則向內(nèi)皮細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化等[14-15]。這提示如果給予胚胎干細(xì)胞特定的牙齒上皮信息，在體外是否可將其向牙齒上皮方向誘導(dǎo)分化？本研究旨在探索胚胎干細(xì)胞向牙齒上皮細(xì)胞分化的可能性，為尋找牙齒再生的種子細(xì)胞提供研究參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生7 d C57小鼠。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)認(rèn)證批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

高糖DMEM 培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))；胎牛血清(Gibco，美國(guó))； Dispase(Sigma 美國(guó))； I型膠原酶(Sigma，美國(guó))； 2-巰基乙醇(Gibco，美國(guó))； 0.25%胰蛋白酶(Sigma美國(guó))；非必須氨基酸(Gibco，美國(guó))；白血病抑制因子(Gibco，美國(guó))；上皮細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco，美國(guó))；瓊脂糖(Sigma，美國(guó))；引物(上海生物工程公司)；抗小鼠一抗：DSP(Santa Cruz Biotechnology，美國(guó))，AMBN(Santa Cruz Biotechnology，美國(guó))，AMGN(Santa Cruz Biotechnology，美國(guó))，CK14(Bioworld Technology，美國(guó))，DMP-1(Santa Cruz Biotechnology，美國(guó))；Hoechst 33342(Sigma，美國(guó))。

1.3 制備成釉細(xì)胞無(wú)血清條件培養(yǎng)液ameloblast serum-free conditioned medium(ASF-CM)

將10只7 d C57仔鼠斷頭，分離上、下頜，僅留下頜骨。體視顯微鏡下分離下頜切牙完整牙胚，將切牙唇側(cè)面的成釉上皮小心地分離下來(lái)并剪成3段，浸泡于含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中待用。將成釉上皮組織剪碎后原代培養(yǎng)，獲得單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞濃度置1×105/mL，接種于培養(yǎng)瓶，在37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，2 d換液1次。待細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)后，加入0.25%胰蛋白酶消化，成纖維樣細(xì)胞脫壁，僅上皮樣細(xì)胞貼壁，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，換無(wú)血清上皮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)差別消化，直至培養(yǎng)的上皮細(xì)胞為單一上皮樣細(xì)胞(圖1)。每天換液1次(避光)，置換出的培養(yǎng)液用小濾器過(guò)濾后冷藏備用。

圖1 成釉細(xì)胞的培養(yǎng)

1.4 形成擬胚體

首先消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)。將濃度調(diào)至120 000～160 000個(gè)/mL后進(jìn)行懸滴。以25 μL一滴，均勻地滴至六孔板上蓋內(nèi)表面，隨后放置孵箱中。2 d后，在懸滴液體中可看見(jiàn)一個(gè)白色點(diǎn)狀物，即為擬胚體(圖2)。

圖2 懸滴法生成的擬胚體

1.5 建立小鼠胚胎干細(xì)胞與成釉細(xì)胞共培養(yǎng)體系

將六孔板的每個(gè)孔內(nèi)放置4～5個(gè)擬胚體，培養(yǎng)擬胚體直至貼壁，棄去原有培養(yǎng)基，加入成釉細(xì)胞無(wú)血清條件培養(yǎng)液進(jìn)行共培養(yǎng)，每48 h換液1次，倒置顯微鏡下觀察。

1.6 條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后胚胎干細(xì)胞基因表達(dá)檢測(cè)

RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞是否有牙胚上皮發(fā)育早期關(guān)鍵性基因Pax9及Msx2的表達(dá)，同時(shí)也檢測(cè)胚胎干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)7 d和14 d后是否有上皮細(xì)胞相關(guān)基因CK14及牙源性細(xì)胞特異性標(biāo)記物AMBN，AMGN，DMP1, DSPP的表達(dá)及其表達(dá)的差異。

1.7 條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后胚胎干細(xì)胞免疫表型檢測(cè)

將成釉細(xì)胞無(wú)血清條件培養(yǎng)液誘導(dǎo) 14 d后的胚胎干細(xì)胞制備成細(xì)胞爬片。觀察免疫表型檢測(cè)結(jié)果是否與基因檢測(cè)結(jié)果相一致。其中用到的一抗分別為CK14(1∶200)，AMBN(1∶200)，AMGN(1∶200)，DMP1(1∶200)，DSP(1∶200)。

2 結(jié) 果

2.1 誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化

首先培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞形成擬胚體，隨后經(jīng)成釉細(xì)胞無(wú)血清條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)，2 d后倒置顯微鏡下觀察，擬胚體外周開始有鵝卵石樣的細(xì)胞爬出，類似于上皮樣的細(xì)胞生成，細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，且隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)這種鵝卵石樣的細(xì)胞所占比例逐漸增加，呈放射狀生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)選取兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)：7 d和14 d，鏡下觀察的結(jié)果如圖3A和B所示。

圖3 擬胚體經(jīng)成釉細(xì)胞無(wú)血清條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)7 d和14 d后

2.2 誘導(dǎo)后細(xì)胞基因水平的變化

為了進(jìn)一步明確ASF-CM誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的分化潛能，首先對(duì)經(jīng)ASF-CM誘導(dǎo)3 d的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行分子表型的檢測(cè)， Pax9和Msx2是較特異表達(dá)于牙胚發(fā)育最早期的兩個(gè)基因，觀察誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞是否表達(dá)這兩個(gè)基因，并將未分化的胚胎干細(xì)胞作為陰性對(duì)照。PCR結(jié)果顯示：誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞表達(dá)Pax9和Msx2，而未分化的胚胎干細(xì)胞不表達(dá)這兩個(gè)基因。誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞OCT4仍有弱表達(dá)，說(shuō)明胚胎干細(xì)胞并未分化完全，仍有部分細(xì)胞保留干細(xì)胞的部分特征(圖4)。圖中陰性對(duì)照為未分化的胚胎干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組為經(jīng)ASF-CM誘導(dǎo)3 d的胚胎干細(xì)胞。

圖4 誘導(dǎo)3 d后PCR檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)牙胚發(fā)育早期這兩個(gè)基因的檢測(cè)，初步判斷經(jīng)ASF-CM誘導(dǎo)后胚胎干細(xì)胞有向牙源性細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，但是隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化效率能否增加呢？進(jìn)一步研究表明，胚胎干細(xì)胞經(jīng)ASF-CM誘導(dǎo)7 d后，誘導(dǎo)組可檢測(cè)到CK14、AMBN以及AMGN mRNA 的表達(dá)，而未分化的胚胎干細(xì)胞則未見(jiàn)明顯表達(dá)。DMP1和DSPP表達(dá)陰性，誘導(dǎo)14 d后，CK14、AMBN以及AMGN mRNA 的表達(dá)水平增高。OCT4在誘導(dǎo)14 d后表達(dá)消失，證明胚胎干細(xì)胞已完全分化(圖5)。

1：未分化的胚胎干細(xì)胞；2：胚胎干細(xì)胞經(jīng)ASF-CM誘導(dǎo)7 d后；3：胚胎干細(xì)胞經(jīng)ASF-CM誘導(dǎo)14 d后

圖5胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)7d和14d后PCR結(jié)果

Fig.5PCR results after differentiated embryonic stemcells with ASF-CM for7and14days

2.3 誘導(dǎo)后細(xì)胞表型的變化

為了進(jìn)一步驗(yàn)證RT-PCR結(jié)果，隨后進(jìn)行了免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，ASF-CM誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞14 d后，誘導(dǎo)組表達(dá)CK14、AMBN和AMGN陽(yáng)性(圖6)。

圖6 胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)14 d后表達(dá)CK14、AMBN和AMGN 陽(yáng)性

3 討 論

胚胎干細(xì)胞可以通過(guò)懸滴法形成具有三胚層結(jié)構(gòu)的擬胚體(EBs)。擬胚體因與胚胎的早期發(fā)育相似，被廣泛用于研究器官的發(fā)育以及不同胚層間的相互作用,成為研究干細(xì)胞進(jìn)展重要的技術(shù)手段。

近幾年來(lái)，大量研究結(jié)果表明：早期的牙胚條件培養(yǎng)液可以誘導(dǎo)牙源性間充質(zhì)細(xì)胞和非牙源性間充質(zhì)細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化[16-18]，充分驗(yàn)證了牙胚條件培養(yǎng)液中存在著一些重要的分子，這些因子之間相互傳遞的信息為牙齒的發(fā)生發(fā)育提供了適宜的微環(huán)境[19-20]。基于以上的研究結(jié)果，設(shè)想牙齒上皮的微環(huán)境是否也是一種適宜的誘導(dǎo)微環(huán)境呢？本實(shí)驗(yàn)選擇了發(fā)育期的成釉細(xì)胞并利用成釉細(xì)胞條件培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)微環(huán)境，探討它能否誘導(dǎo)小鼠的胚胎干細(xì)胞向牙齒方向特別是向牙上皮方向轉(zhuǎn)化的能力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)ASF-CM誘導(dǎo)后，胚胎干細(xì)胞可以向上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，細(xì)胞的增值能力增強(qiáng)。誘導(dǎo)后的細(xì)胞部分形態(tài)為鵝卵石樣，與牙齒上皮樣細(xì)胞很相似。分化后的細(xì)胞與牙上皮形態(tài)的相似性提示胚胎干細(xì)胞向牙源性上皮方向轉(zhuǎn)化的可能性。隨后對(duì)誘導(dǎo)3 d的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞表達(dá)Pax9和Msx2，說(shuō)明分化的胚胎干細(xì)胞從表型上開始向牙胚細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化，并模擬牙胚早期的發(fā)育過(guò)程。誘導(dǎo)7 d和14 d的PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)組細(xì)胞均表達(dá)CK14、AMBN、AMGN陽(yáng)性，且表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。CK14、AMBN、AMGN都是牙源性上皮所表達(dá)的基因，其中AMBN為牙胚上皮的特異性基因，PCR結(jié)果證明誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞在成釉細(xì)胞條件培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下可以較特異的向牙源性上皮細(xì)胞方向分化。結(jié)果還表明，誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)DMP1和DSPP陰性，DSPP是成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性的基因之一，DMP1在牙本質(zhì)和骨組織中均有表達(dá)。由此推論，誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞沒(méi)有向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。

為進(jìn)一步驗(yàn)證PCR結(jié)果，誘導(dǎo)組誘導(dǎo)14 d后進(jìn)行了免疫熒光檢測(cè)，陰性對(duì)照為未分化的胚胎干細(xì)胞。免疫熒光結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相一致。說(shuō)明胚胎干細(xì)胞在體外成釉細(xì)胞無(wú)血清條件培養(yǎng)液所提供的成牙微環(huán)境的誘導(dǎo)下具有分化的潛能，可向成牙上皮細(xì)胞方向分化。

然而，本實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有明確ASF-CM 中起關(guān)鍵作用的信號(hào)分子。這將是今后研究的重點(diǎn)。以往有研究表明，上皮培養(yǎng)液中有一些信號(hào)分子如Notch-1、TGF-βs、BMPs和FGFs等，這些分子間的相互作用可能使胚胎干細(xì)胞向牙齒上皮方向分化[21-22]。由此推論：這些發(fā)育早期的牙胚上皮細(xì)胞能夠保持成牙能力，所含的特定信號(hào)分子能夠誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向成牙方向分化。接下來(lái)的研究應(yīng)當(dāng)從如何提高誘導(dǎo)效率以及從誘導(dǎo)微環(huán)境中篩選出關(guān)鍵性的信號(hào)因子這兩方面進(jìn)一步使研究深入化。