“黑美人”馬鈴薯原花青素代謝物動態分析

楊曉輝，蔡慧珍，汪 嶺，趙 聰

（寧夏醫科大學公共衛生與管理學院，寧夏銀川 750004）

0 引言

原花青素（Proanthocyanidins，PC）作為一種自然界存在的黃酮類聚合物［1］，又名縮合鞣質，廣泛存在于植物界和食品中，具有很強的生物活性［2］，且安全性高。原花青素被認為是目前清除體內自由基最為有效的天然抗氧化成分之一［3］，具有抗氧化、降低血脂、降低血糖、抗癌、免疫調節等多種功效［4］，并有防止心血管疾病、抗輻射、防血小板凝結等作用［5-6］。因此，原花青素在藥品、保健品、食品及化妝品等多領域應用廣泛［7］。目前關于原花青素的研究也卓有成效，但大多是關于原花青素的提取、結構及生理活性的研究，原花青素在體內的吸收和代謝過程的研究還需要進一步深入［8］。

經研究表明：“黑美人”馬鈴薯原花青素含量較高，其營養價值比普通馬鈴薯高［9］。筆者經過試驗發現，“黑美人”馬鈴薯中原花青素在大鼠血清、尿液、糞便中均有不同含量的存在，且灌胃天數不同，其含量差異較大，但其在體內的吸收和代謝過程尚不明確。本研究將采用液相色譜-質譜聯用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）技術對“黑美人”馬鈴薯原花青素給藥大鼠不同給藥天數的尿液和糞便中代謝產物進行分析，研究“黑美人”馬鈴薯原花青素的主要代謝產物及其動態變化規律，探討“黑美人”馬鈴薯原花青素的代謝特征，為“黑美人”馬鈴薯原花青素體內代謝機制探索提供依據。

1 實驗部分

1.1 實驗動物

成年SD大鼠20只（雌雄各半）。

1.2 儀器與試劑

Rapid Trace SPE自動固相萃取儀（瑞典Biotage AB公司）；1100液相色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫公司）；九陽料理機（JYL-C012-九陽股份有限公司）；高速離心機（Neofuge15R-上海力申科學儀器有限公司）；數控超聲波系統（KQ-100DE-昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

“黑美人”馬鈴薯；原花青素標準品（95%）（北京上立方聯合化工技術研究院）；乙酸乙酯；無水乙醇；甲酸；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

1.3“黑美人”馬鈴薯原花青素的制備

將“黑美人”馬鈴薯洗凈、晾干，用榨汁機制成勻漿，精確稱取100.0 g于燒杯中，依照料液比例1∶7.5（W/V）加入75%的乙醇溶液，并在60℃超聲波儀中提取30 min。將提取后的溶液在離心沉降器上以轉速為1 000～3 000 rpm遞增的速度離心5 min，將上清液進行真空抽濾，揮發除去揮發性萃取劑，并使用AB-8大孔吸附柱分離和純化，得到原花青素粉末。

1.4 樣本采集與前處理

1.4.1 樣本采集

將成年SD大鼠隨機分為實驗組和對照組（實驗組和對照組分別分成1，2，3，5，7 d組，每組雌雄各半）。實驗組給予“黑美人”馬鈴薯原花青素的提取物，以150 mg/（kg·d）的劑量灌胃給藥，對照組給予相應劑量的生理鹽水，分別灌胃給藥1，2，3，5，7 d，管飼量為大鼠體重的1%，每日上午十點左右灌胃，其他飲食保持正常，將大鼠放在代謝籠中單籠喂養。分別收集1，2，3，5，7 d組大鼠的排泄物（尿液、糞便），清晰標記，并保存在-80℃的冰箱中。

1.4.2 樣本的提取與凈化

分別精確稱量不同天數的SD大鼠尿液1.0 mL置于試管中，按照1∶9（V∶V）加入75%的乙醇溶液，于60℃超聲波提取1 h，離心取上清液；取不同給藥天數的SD大鼠糞便，研磨成粉末，分別稱取1.0 g，按1∶9（W∶V）加入75%的乙醇溶液，并在60℃超聲波儀中提取1 h，離心取上清液。上述各組上清液經旋轉蒸發儀減壓濃縮，乙酸乙酯萃取后溶于30%乙醇中，將其轉移至已活化的C18固相萃取小柱中純化，收集樣液，于0.25μm有機微孔濾膜進行過濾，進行HPLCMS分析。

1.5 液相色譜-質譜條件

LC條件：色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）。洗脫梯度（0～10 min，A 5%～10%；10～20 min，A 10%～15%；20～30 min，A 15%～20%；30～40 min，A 20%～40%；40～50 min，A 40%～60%）；流速1 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫45℃。

ESI-MS條件：采用電噴霧離子源（ESI）電離，負離子模式下采集數據，孔壓－30 V；霧化壓力4 kV；氣體流速20 mL/min；離子源溫度325℃；質譜離子掃描范圍100～1 200 m/z。

1.6 數據處理

數據以X±S表示，由Origin8.0軟件進行分析，組間差異表現為P＜0.05和P＜0.01。

2 結果與討論

2.1 大鼠尿液中代謝產物及動態分析

在1.5所述條件下，將純化后1，2，3，5，7 d對照組和實驗組給藥大鼠尿液中原花青素的代謝產物進行LC-MS分析，總離子流如圖1所示。結合標準品的保留時間和質譜信息分析表明，在實驗組的尿液代謝產物中有（-）-表兒茶素（產物Ⅰ）、表兒茶素芐硫醇（產物Ⅱ）和m-香豆酸（產物Ⅲ），且三者含量在給藥1，2，3 d有明顯差別（如圖2所示），然而，3種化合物在對照組的尿液代謝產物中未檢測到。根據統計學分析，實驗組給藥3 d后SD大鼠尿液中代謝產物的響應值最高，3 d后大鼠代謝趨于穩定，但都和對照組尿液的檢出值存在顯著性差異（P＜0.01）。

圖1 實驗組（a）和對照組（b）給藥3d后尿液代謝產物的LC-MS總離子流

圖2 實驗組大鼠給藥前后7 d尿液代謝產物的含量變化

筆者在前期的實驗中發現，“黑美人”馬鈴薯原花青素主要是由表兒茶素結構單元組成的原花青素聚合物，本實驗中，尿液中原花青素的代謝產物（-）-表兒茶素和表兒茶素芐硫醇的濃度先升高后逐漸平穩，這可能是由于在開始給藥時動物對外源物質的耐受性較差以及體內酚類物質的代謝酶活性沒有被完全激活，隨著原花青素被利用的程度逐漸增加，代謝產生的酚類化合物的含量相應增加。m-香豆酸是由腸道微生物群降解黃烷醇產生的重要酚酸，具有多種抗氧化和抗炎活性，因此，原花青素可以通過增加尿液中酚類物質的排泄來增加尿液的抗氧化活性，進而對整個尿路的免疫機能產生正面影響［10］。

2.2 大鼠糞便中代謝產物及動態分析

在1.5所述條件下，將純化后1，2，3，5，7 d的對照組和實驗組給藥大鼠糞便中原花青素的代謝產物進行LC-MS分析，總離子流如圖3所示。結合標品的保留時間和質譜信息分析表明，實驗組的糞便代謝產物中仍然有表兒茶素芐硫醇（化合物Ⅱ）和m-香豆酸（化合物Ⅲ）存在，但其含量低于尿液，未檢出化合物（-）-表兒茶素。糞便中表兒茶素芐硫醇和m-香豆酸含量在給藥1，2 d有明顯差別（見圖4），在對照組的糞便代謝產物中未檢測到這兩種化合物。根據統計學分析，實驗組給藥2 d后SD大鼠糞便中二種代謝產物的響應值最高，3 d后SD大鼠的代謝趨于穩定，但都和對照組糞便的檢出值存在顯著性差異（P＜0.01）。“黑美人”馬鈴薯原花青素通過糞便排泄的代謝產物主要有兩種，不僅遠沒有尿液排泄的復雜途徑，并且含量均較低。

圖3 實驗組（a）和對照組（b）給藥2 d后糞便代謝產物的LC-MS總離子流

圖4 實驗組大鼠給藥前后7 d糞便代謝產物的含量變化

3 結語

“黑美人”馬鈴薯原花青素在SD大鼠尿液和糞便中的排泄及其作用與代謝途徑密切相關。本研究采用LC-MS法對“黑美人”馬鈴薯原花青素給藥SD大鼠不同給藥天數的尿液和糞便中代謝產物進行分析，篩選出表兒茶素芐硫醇和m-香豆酸為主要代謝成分，并研究其動態變化，為“黑美人”馬鈴薯原花青素的體內代謝機制探索提供依據。