免疫組化法檢測CD73和轉錄因子叉頭框C2對上皮性卵巢腫瘤檢測的價值

賴廣華，楊曉婷，賴名溪，卓李圓

（廣東省深圳市龍華區中心醫院 病理科，廣東 深圳 518110）

卵巢腫瘤是僅次于宮頸癌和子宮內膜癌的婦科腫瘤，以上皮型最為多見，由于早期缺乏特異的臨床癥狀和可靠的診斷方法，絕大多數患者發現時已經出現遠處轉移而錯失了治療良機。隨著醫療水平的迅猛發展，從分子生物學水平研究腫瘤的發生和發展成為熱點。CD73 是一種T 淋巴細胞分化抗原，廣泛存在于多種組織中，參與離子交換、液體轉運等生理過程。近年來有學者發現多種惡性腫瘤中出現CD73 高表達，并與腫瘤組織的微血管密度和侵襲轉移密切相關［1］。轉錄因子叉頭框C2（forkhead box protein C2, FOXC2）是胚胎時期與血管及淋巴管形成有關的重要因子，隨著腫瘤分子生物學的興起，研究者們發現FOXC2還是宮頸癌發生、發展、轉移和侵襲的必要因子，并在子宮內膜癌也存在高表達現象［2］。但CD73、FOXC2 在上皮性卵巢腫瘤中的表達和臨床-病理關系報道甚少，本研究就這一方向展開討論，以期為卵巢腫瘤的早期診斷、預后評估及靶向治療提供新思路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2017 年6 月至2018 年10 月手術切除的卵巢組織標本130 例為研究對象，均為首次手術，術前未接受放化療，無其他部位腫瘤病史，均經病理確診，患者對本次研究知情同意、臨床及隨訪資料完整。入選患者年齡為27～75 歲，平均（46.4±9.3）歲；其中良性上皮性腫瘤30 例（漿液性15 例，粘液性15 例），交界性上皮性腫瘤35 例（漿液性18 例，粘液性17 例），惡性上皮性腫瘤45 例（漿液性29 例，粘液性16 例；臨床Ⅰ～Ⅱ期14 例，Ⅲ～Ⅳ期31 例；淋巴結轉移24 例，無轉移21 例；病理組織學分級：G1 9 例，G2 15 例，G3 21 例），因其他疾病切除的正常卵巢組織20 例。正常組織及病變組織標本均為兩份。

1.2 儀器與試劑

BX-51 熒光顯微鏡（日本尼康公司）；鼠抗人CD73 單克隆抗體、鼠抗人FOXC2 單克隆抗體、免疫組化染色試劑盒、山羊血清（北京中杉生物公司）；非生物素免疫組化檢測系統（北京中杉生物公司）

1.3 方法

采用免疫組化法檢測卵巢組織標本中CD73、FOXC2 的表達，以已知陽性切片為陽性對照，以硫化鉛代替一抗為陰性對照。取出經烤片、脫蠟、逐級乙醇、3%過氧化氫溶液處理后的標本（一式兩份），PBS 液清洗3 次，在弱酸液中進行高溫高壓修復。加入10%山羊血清中和非特異反應。同一患者的兩份標本分別加入一抗（1∶200）鼠抗人CD73 單克隆抗體和鼠抗人FOXC2 單克隆抗體，4℃冰箱中保存過夜。復溫后加入二抗（PV6000通用型抗體）。DAB 染色液染色，蘇木素復染，乙醇脫水，樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4 結果判定

CD73 位于包膜或胞漿，鏡下細胞結構清晰，陽性表達的判定標準：電鏡下發現胞漿和包膜出現棕黃色或褐色顆粒，突出于背景細胞顏色。表達強度判定：細胞無著色或淡黃色計1 分，棕黃色計2 分，棕褐色計3 分；取5 個視野，每個視野計100 個細胞，陽性細胞占0%～10%計1 分，＞10%～50%計2 分，＞50%～100%計3 分。記錄兩項評分乘積：1～3 分為低表達，≥4 分為高表達（強度Ⅰ級為4 分，Ⅱ級為6 分，Ⅲ級為9 分）。FOXC2 位于胞漿和胞核，鏡下呈現棕黃或棕褐色顆粒為陽性表達。表達強度判定：細胞不著色計0 分，淡黃色計1 分，棕黃色計2 分，棕褐色計3 分；陽性細胞占0%～10%計1 分，＞10%～50%計2 分，＞50%～80%計3 分，＞80%～100%計3 分。記錄兩項評分乘積：0～2 分為陰性（-），3、4 分為弱陽性（+），6、8 分為陽性（++），9、12 分為強陽性（+++）。

1.5 統計學方法

本次研究中所涉及到的數據均采用SPSS 20.0軟件進行整理和分析。計數資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，相關性檢驗采用Spearman 相關分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD73 在不同卵巢組織中的表達

鏡下可見上皮性卵巢癌組織細胞的胞漿、包膜上出現棕黃或棕褐色顆粒，突出于背景細胞，視野中幾乎被陽性細胞充滿；交界性上皮性卵巢腫瘤組織也出現棕黃色顆粒，分布較卵巢癌組織稀疏；正常卵巢組織幾乎無染色，見圖1。CD73在正常、良性、交界性及惡性卵巢組織中的高強度表達率分別為0.0%、20.0%、25.7% 和82.2%，兩兩比較，良性與交界性卵巢組織CD73 高表達率差異無統計學意義（χ2=0.297,P=0.586），正常卵巢組織CD73 高表達率均低于良性、交界性及惡性卵巢組織，組間差異均有統計學意義（χ2=4.546,P=0.033；χ2=6.149,P=0.013；χ2=38.175,P=0.000），見表1。

2.2 FOXC2 在不同卵巢組織中的表達

鏡下可見上皮性卵巢癌組織細胞胞漿和胞核中呈現棕褐色顆粒狀，陽性細胞占視野比例大；良性上皮性卵巢腫瘤組織染色較淺，呈棕黃色，陽性細胞占視野比例較惡性小；正常卵巢組織未見染色細胞，見圖2。FOXC2 在正常、良性、交界性及惡性卵巢組織中的陽性表達率分別為5.0%、23.3%、28.6% 和86.7%，兩兩比較，良性與交界性卵巢組織FOXC2 陽性表達率差異無統計學意義（χ2=0.230,P=0.632），正常卵巢組織FOXC2 陽性表達率均低于良性、交界性及惡性卵巢組織，組間比較差異均有統計學意義（χ2=3.562,P=0.046；χ2=4.420,P=0.036；χ2=39.016,P=0.000），見表1。

圖1 鏡下所見CD73 在不同卵巢組織中的表達情況

表1 不同卵巢組織中CD73、FOXC2 的表達情況 （n=130）

圖2 鏡下所見FOXC2 在不同卵巢組織中的表達情況

2.3 上皮性卵巢腫瘤CD73、FOXC2 表達與臨床病理參數的關系

上皮性卵巢腫瘤CD73 高表達率及FOXC2 陽性率與組織學分級、臨床分期及有無淋巴結轉移有關（P＜0.05），組織學級別高、臨床中晚期及有淋巴結轉移的腫瘤組織CD73 高表達率高、FOXC2陽性率高。上皮性卵巢腫瘤CD73、FOXC2 表達與年齡及組織學分型無關（P＞0.05），見表2。

2.4 上皮性卵巢腫瘤CD73、FOXC2 表達相關性

Spearman 相關分析顯示，上皮性卵巢腫瘤CD73 與FOXC2 表達呈線性正相關關系（r=0.833,P=0.004）。

表2 上皮性卵巢腫瘤CD73、FOXC2 表達與臨床病理參數的關系

3 討論

卵巢癌是女性最常見的生殖系統惡性腫瘤之一，其起病隱匿，發病機制復雜，手術難度大，5年生存率低，需要先進的早期診斷技術和治療手段。基因水平的治療和疾病發掘一直是精準醫學努力的方向，目前廣泛應用于腫瘤相關疾病的治療過程中［3］。本研究對上皮性卵巢癌進行分子水平的新型標志物的探究。

CD73 是通過糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol, GPI）錨定在細胞膜上的一種多功能糖蛋白，其不僅在T 淋巴細胞中具有刺激信號分子的作用，并且在淋巴細胞與內皮細胞結合的過程中充當黏附分子的角色［4］。機體絕大多數組織中可檢測到CD73 表達，CD73 附著于組織細胞的胞膜或游離于胞漿中，參與離子交換、液體轉運、組織乏氧及血管滲漏等病理生理過程［5-6］。FOXC2 是具有 DNA-結合域的翼狀螺旋轉錄因子超家族中的一員，可在血管、軟骨組織、腎臟及間質等部位表達，在胚胎的發育中起重要作用［7-8］。近年來，研究發現 CD73、FOXC2 與上皮性卵巢腫瘤的關系較為密切，Munger 等人在體外用惡性腹腔積液處理卵巢癌細胞，發現胞漿中CD73 和 FOXC2 的表達明顯上調［9-10］。Kriplani 還通過體內試驗證實了CD73 高強度表達與腫瘤組織微血管形成、侵襲和轉移有關，他認為卵巢腫瘤微環境的改變可能是誘導CD73 高表達的原因之一，反之CD73 高表達也促進了血管淋巴管生成，為腫瘤細胞提供更充足的養分，造成了分子表達與微環境之間相互促進這一惡性循環［11-12］。

本研究結果顯示，CD73 與FOXC2 在上皮性卵巢腫瘤細胞中呈現棕黃色或棕褐色、突出于背景的顆粒狀表達，惡性組織細胞中CD73 呈高強度表達，表達率為82.2%，FOXC2 陽性率為86.7%，顯著高于良性及交界性組織，差異有統計學意義（P＜0.05），進一步提示了在惡性上皮性卵巢腫瘤的發病和病情惡化中CD73 可能起到關鍵作用。良性與交界性卵巢腫瘤CD73 表達強度介于惡性組織和正常組織之間。這一差別使得CD73、FOXC2 作為不同良惡程度卵巢腫瘤鑒別依據成為可能。但產生這一現象的原因尚未明確，除了微環境假說外，還可能與腫瘤組織中乏氧誘導致癌信號增加，促進CD73、FOXC2 表達有關，炎癥因子低氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）、轉化生長因子-β （transforming growth factor-β, TGF-β） 可能也參與其中［13-14］。本研究還發現 CD73、FOXC2 高表達與組織學分級、臨床分期及有無淋巴結轉移有關，組織學級別高、臨床中晚期及有淋巴結轉移的腫瘤組織CD73、FOXC2 表達強度高。可能與CD73、FOXC2 促進腫瘤組織微血管生成，增加癌細胞側向運動能力有關，與卵巢腫瘤臨床病理特征的這一相關性可作為評估療效和預后方法［15］。Spearman 相關分析顯示，CD73 與FOXC2 在上皮性卵巢腫瘤的表達呈正相關關系（r=0.833,P=0.004），兩種標志物的聯合分析對于上皮性卵巢癌的早期診斷和預后評估具有重要的意義。

綜上所述，在上皮性卵巢腫瘤細胞中CD73 與FOXC2 呈現高強度表達，并與腫瘤的轉移和侵襲密切相關，可作為上皮性卵巢腫瘤早期診斷和預后評估的免疫分子標志物。