煙草水提物對果蠅壽命及有關基因轉錄的影響

白謹銘 趙子翔 秦嘉晨 劉鑒輝 梁愛博

（山東農業大學生命科學學院，泰安 271018）

隨著生活質量的提高和環境及衛生狀況的改善，人們對自身的健康狀況的日益關注，使得我國國民壽命整體得到提升［1］。壽命除受到先天基因遺傳影響，也與后天環境有很大的關系［2］。

果蠅生命周期短，并且與人類高度同源，是一種十分適合進行壽命研究的模式動物［3］。2000年，Science報道，果蠅的基因測序已經基本完成［4］，使在各個領域對果蠅的研究均得到廣泛應用并取得重大突破，這意味著果蠅可作為研究人類健康有關問題的最佳模式動物［3，5-6］。

吸煙是一種潛在的可能加速衰老從而影響壽命的環境因素，已然成為影響人類的非常嚴重的公共環境衛生問題［7］。研究發現，主動吸煙與被動吸煙都都會嚴重危害人類健康［8-9］。根據世界衛生組織（WHO）的統計數字，每年全世界因吸煙而死亡的人數達到600萬；煙民中將會有半數因吸煙而提早死亡；暴露在煙霧中的被動吸煙者每年死亡人數約為60萬。香煙的煙霧成分極其復雜，由若干復雜的有機物以及很多種氣體和微粒組成［10］，包括很多能引起組織炎癥、致癌及其他危及身體健康的毒性成分［11］，會對人類健康造成極大的損害，并影響人類壽命［10］。

影響壽命與衰老的基因有許多類：通過調節代謝而影響壽命的基因有SOD1、SOD2、CAT、GSHPx（在果蠅中同源物為PHGPx），SOD、CAT和PHGPx能夠發生協同作用，作為O2-清除劑，使O2-轉化為O2，解除氧化脅迫對機體的損傷［12］。參與機體泛素化調節與蛋白酶活性調節從而影響壽命的有Usp7、Rpn11等，機體在經過應激反應后產生大量變性蛋白，usp7、Rpn11在變性蛋白去泛素化重新回收利用的過程中起到重要作用，并且可以抑制腫瘤產生［13-14］。之前報道過MTH及Sirt基因家族與果蠅的壽命也有著密切的關系，MTH突變體會比其父本延長壽命35%［15-17］，Sirt家族的基因表達降低會降低正常的壽命［18-19］。

雖然吸煙有害健康，但是煙草是否或怎樣影響生物體的壽命與衰老依然沒有明確的定論，因此借助果蠅模型探究煙草對壽命與衰老的影響具有極大的現實意義。我們希望通過研究煙草對果蠅壽命影響的機制，為吸煙的有害性提供切實明確的實驗證據與理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 W1118系黑腹果蠅，來自山東農業大學動物發育實驗室。

1.1.2 香煙 哈德門香煙（市售軟包裝，煙堿量：1.0 mg）

1.1.3 酵母粉（安琪酵母有限公司）；葡萄糖（天津市凱通化學試劑有限公司）；玉米粉（吉林中糧生化能源銷售有限公司）；瓊脂（Solarbio Life Sciences）；尼 泊 金 甲 酯（BBL Life Sciences）；0.45 μm 濾 膜（Millipore）；Trizol（Sangon Biotech）；HiScript?QRT Super Mix with gDNA wiper（Vazyme）；ChamQ SYBR?Color qPCR Master Mix（Vazyme）。

1.1.4 儀器 生化培養箱（江南同君儀器有限公司 HPS-280）；體視顯微鏡（奧林巴斯有限公司SZ61-SET）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠 LDZX-50KBS）；熒光定量PCR儀（BIO-RAD CFX96）；超純水機（Millipore Milli-Q Integral）。

1.2 方法

1.2.1 浸出煙草內含物 將哈德門香煙去除香煙外的包裝紙得到煙絲，用電子天平稱取煙絲1 g、2 g和3 g，用100 mL重蒸水浸泡24 h，使用0.45 μm濾膜過濾，得煙草提取液，在4℃下保存備用。

1.2.2 制備果蠅培養基 將酵母粉80 g/L加水煮沸20 min后，加入葡萄糖110 g/L、玉米粉40 g/L、瓊脂7.5g/L后再次煮沸，冷卻至65℃并加入尼泊金甲酯1.5 g/L。再加入培養基質量1/10的純凈水或不同濃度的煙草提取液并混勻，趁熱倒入平底玻璃培養管（Φ=3.0 cm）中，高度約為1 cm。

1.2.3 構建受煙草影響的果蠅模型 使用二氧化碳進行麻醉，挑選剛孵化未滿12 h的雄性果蠅，培養于空白對照培養基（CK）與各不同濃度的煙草培養基（1 g/d、2 g/d和3 g/d）中，每種處理下至少150只。于溫度（25±1）℃濕度（70±10）%的生化培養箱中培養，每天定時檢查記錄果蠅存活情況并更換培養基。

1.2.4 提取樣本總RNA 選取特定時間點的雄性果蠅進行稱重，研磨得到果蠅勻漿，利用改良后的Trizol法［20］提取果蠅總RNA，在RNase-free離心管中加入500 μL Trizol，室溫靜置3 min后4℃ 12 000×g離心10 min，取上清液，加200 μL氯仿，震蕩15 s，室溫靜置2-3 min后4℃ 12 000×g離心15 min，取上清液，加等體積異丙醇，混勻，冰浴靜置10 min后 4℃ 12 000×g離心 10 min，用 500 μL 70% 乙醇漂洗后4℃ 12 000×g離心5 min，去上清液，晾干，加入適量DEPC milliQ溶解獲得樣本總RNA。

1.2.5 Real-time PCR檢測基因表達變化 取1 mg RNA，依照說明書使用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。得到樣本cDNA后，使用熒光定量儀，依照說明書使用熒光定量試劑盒檢測有關基因表達變化，所用引物見表1。以Actin、β-Tubulin基因作為內參，經均一化處理后分析基因表達改變情況。

1.2.6 統計分析 使用Origin 9.0軟件進行統計分析。所有數據至少來自3次獨立重復，并通過t檢驗、Breslow檢驗或單因素方差分析進行分析，然后進行Least-Significant Difference檢驗進行多重比較，P＜0.05被認為具有統計學意義。在未顯示精確P值的情況下，統計顯著性顯示為*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 ；不同小寫字母表示P＜0.05。

表1 兩種內參基因與9種與衰老相關基因的Real-time PCR引物

2 結果

2.1 煙草影響果蠅壽命

動物種群的平均壽命和半數死亡時間是衡量群體預期壽命的重要數據。因此，我們通過每天在固定時間更換果蠅培養基并統計果蠅的死亡情況。實驗發現，不同濃度的煙草處理（1 g/d、2 g/d和3 g/d）對雄性果蠅平均壽命和半數死亡時間的影響，如圖1所示。圖中所有處理組的兩個壽命指標均低于對照組，當煙草達到一定濃度時，果蠅的壽命顯著降低。煙草對果蠅的平均日存活率的影響，如圖2所示。結合圖1可以發現煙草對果蠅壽命的不利影響具有劑量效應，其隨著煙草濃度的增加而增加，最終導致日均存活率與對照組相比出現顯著差異。

2.2 煙草影響雄性果蠅的基因表達

體內CAT、SOD2和Rpn11的表達顯著上調，Sirt6的表達顯著下調；14 d后，果蠅體內PHGPx、SOD2和MTH的表達顯著上調，Sirt6的表達超顯著下調。21 d后，果蠅體內CAT的表達極顯著上調，SOD1、SOD2、Sirt2、Usp7和Rpn11的表達超顯著上調，PHGPx和MTH的表達顯著上調，Sirt6的表達超顯著下調。隨著影響時間的延長，果蠅中越來越多的基因受到影響，受影響的情況也更加嚴重。

圖1 煙草處理對雄性果蠅壽命的影響

圖2 煙草處理下雄性果蠅壽命曲線

為了揭示果蠅壽命縮短的原因，我們分別在第7天，第14天和第21天檢測了可能與衰老或壽命相關的幾個基因的表達情況。在煙草的影響下，果蠅中的一些基因表達水平發生了顯著的變化。通過Real-time PCR技術檢測了與果蠅衰老和壽命相關的9個基因。結果如圖3所示。煙草處理7 d后，果蠅

3 討論

隨著人們對于延長壽命、減緩衰老等問題越來越關注，此類研究已成為一大熱點。近年來人們通過研究存活率、抗氧化酶活性以及與衰老相關基因表達情況，發現了越來越多的物質具有抗氧化、延緩衰老的作用［21-22］，這為人類健康，延長壽命作出了巨大貢獻。本實驗在通過研究存活率以及衰老相關基因表達情況中發現，煙草影響將會導致果蠅壽命的縮短。

煙草影響到億萬煙民乃至國計民生，其帶來的健康危害也不容小覷。由于果蠅的衰老基因和代謝途徑與人類非常相近，本研究以W1118系黑腹果蠅為材料，通過水浸泡煙草提取煙草內物質處理果蠅，測定了果蠅的壽命和與衰老有關的基因表達情況。結果發現吸煙會縮短果蠅的壽命，對果蠅生存產生不利影響，甚至引起果蠅體內某些基因表達的變化。在煙草的影響下，幾種抗氧化酶的表達水平增加，表明在煙草刺激下果蠅遭受了某種氧化脅迫，其很有可能導致果蠅的衰老加速。有研究表明，吸煙會導致細胞遭受氧化脅迫［23］，產生過多的ROS而導致活性氧消除系統有關酶類和抗氧化物質的量顯著上升，這與本研究發現的煙草導致抗氧化酶基因表達量升高具有一致性。Sirt6的表達水平降低也可能說明煙草處理對果蠅細胞造成不利影響和氧化脅迫，之前研究發現Sirt家族蛋白質是一種在調節氧化應激和壽命中發揮出關鍵作用的蛋白質，過表達Sirt家族基因可以顯著增長機體的壽命［19］，煙草影響導致Sirt6表達降低進而影響了果蠅的壽命。Rpn11被報道編碼一種促進26S蛋白酶體活性的蛋白質［13］，其增加暗示煙草引起了氧化脅迫，使得細胞內蛋白質受到活性氧影響而未折疊或錯誤折疊，最終激活泛素途徑降解［24］。MTH的表達升高也暗示了一種負面影響，因該基因作用機制仍不明確，只發現敲除該基因會使雄性果蠅壽命顯著升高，與壽命存在負相關關系［17］。我們認為煙草影響主要導致果蠅遭受氧化脅迫進而引起早衰，近年來的研究還證實了煙草能導致腫瘤的產生，影響卵巢正常功能等諸多的疾?。?5-26］，這些疾病可能與氧化損傷一起影響到機體的健康與壽命。

對于煙草的萃取人們通常采用水或80%的甲醇水溶液提取，相比有機溶劑，用水提取成本低、污染小且對果蠅不會產生其他影響，在煙草行業標準YC/T 251-2008 中也采用水萃取樣品［27］。在之前相關的實驗中，我們發現用水浸泡煙草與過濾燃燒后的煙氣兩種方式提取煙草內物質對果蠅的影響十分相似，因此我們利用果蠅的開管循環系統，巧妙地以消化道為途徑通過飼喂含煙草成分的培養基來處理果蠅，構建受煙草影響的果蠅模型。在之前我們也發現，通過四層紗布簡單過濾的煙草提取液制成的培養基，可以在很低的濃度引起雌性果蠅壽命出現顯著降低本研究中使用0.45 μm濾膜對煙草提取液進行過濾發現，對果蠅壽命產生影響所需的濃度閾值提高了很多，這也與近期的研究結論一致［28］。因此，香煙濾嘴的過濾質量對吸煙人群健康的影響也是不容忽視的。

從宏觀的群體平均壽命與微觀的基因表達調控的角度，我們均發現煙草會對果蠅的健康產生不利影響，煙草也很可能對人的生命產生不利影響，其通過使身體受到氧化損傷而加速衰老。從社會學的角度來看，本研究可以為吸煙引起早衰提供理論依據，能使人們更深入地了解煙草的危害。未來，我們也希望從煙草對蛋白質水平的影響和煙草引起早衰的分子機制進行更深入研究。

4 結論

本研究通過重蒸水浸泡香煙煙絲提取煙草內物質，雄性果蠅經煙草影響后壽命出現了顯著縮短，且該影響具有劑量效應。果蠅體內多種抗氧化酶轉錄水平出現上調，泛素化調節酶與乙?；皋D錄水平也出現改變，暗示氧化脅迫導致果蠅機體出現早衰。