牛奶過敏原β- 乳球蛋白的重組制備及磁微粒化學發光檢測法的建立

杭鑫茹 耿榮慶 錢林

（1. 南京工業大學，南京 210000；2. 鹽城師范學院，鹽城 224051；3. 江蘇省免疫診斷工程技術研究中心，蘇州 215028）

過敏性疾病又稱變態反應性疾病，是當前世界性的重大衛生學問題。世界衛生組織（WHO）將過敏列為21世紀重點防治的三大疾病之一［1-5］，全球發病率約為15%-30%，我國約5%-10%的人患有過敏，且發病率逐年上升。

牛奶中含有豐富的蛋白質組分，為人類提供了重要的營養，改善著人類的健康狀況，更是嬰幼兒飲食中添加最早的食物之一。然而，牛奶作為八大主要食物過敏原之一，能引起嚴重的過敏反應。特別是牛奶中的多種蛋白質都能引起食物過敏反應，兒童的牛奶過敏發生率已高達1.2%-17%［6-8］。β-乳球蛋白、酪蛋白和α-乳白蛋白是牛奶過敏原組分中含量最多、致敏性最強的蛋白組分［9］。牛奶過敏可劃分為IgE介導和非IgE介導，在IgE介導的牛奶過敏性疾病中大約有60%是由β-乳球蛋白引起［10］。β-乳球蛋白也被稱為Bosd5，分子量為18.3 kD，由178個氨基酸組成，在牛奶中占比約10%，其在乳清中則含量很高，約占乳清總蛋白的50%［11］。

牛奶過敏原檢測的方法主要基于蛋白水平和核酸水平［12-13］，在蛋白水平上包括電泳法、色譜法、酶聯免疫吸附法（ELISA）、生物免疫傳感器法、質譜蛋白質組學（LC-MS/MS）等檢測技術，在核酸水平上通常采用普通聚合酶鏈式反應和實時熒光定量PCR等檢測技術。雖然這些方法在一定程度上能夠滿足檢測的靈敏度和準確性要求，但還沒有一種方法可以滿足多樣化的樣品檢測要求。隨著現代分析技術的快速發展，自動化、高通量、高靈敏度、高準確度和低成本等特點的檢測方法是牛奶過敏原檢測的發展方向。

納米磁微粒化學發光免疫分析技術是以納米級磁性微粒做固相載體，使抗原、抗體最大限度結合，且兼具化學發光與酶免疫技術的優點，以化學發光劑為底物的酶免疫技術［14］。其原理是磁微粒上連接鏈霉親和素，抗原進行生物素化后通過生物素-親和素特異性結合形成固相抗原；血清中抗體和固相抗原反應，再加入被酶標記過的二抗；然后加入酶促化學發光底物，在酶作用下底物被催化裂解，形成激發態中間體，當激發態中間體回到基態時發出光子，儀器接受光信號，測定光強度，以強度的強弱反應待檢樣品中抗原或者抗體的含量。與傳統的免疫印跡及酶聯免疫法相比，納米磁微粒法具有高靈敏度和特異性以及寬線性范圍的優點，結合全自動高靈敏度的全自動化學發光儀，在體外診斷領域得到越來越多的關注和應用。

本研究構建體外載體表達系統以制備重組β-乳球蛋白，經分離純化后采用生物素標記，通過在納米磁微粒化學發光免疫平臺上檢測驗證，建立穩定的納米磁微粒化學發光免疫檢測方法，旨為研制滿足市場需要的牛奶過敏原檢測技術奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內切酶BamH I、XhoI和ScaI購買于美國Thermo公司；生物素標記試劑盒購于英國Innova Biosciences公司；無內毒素質粒小提中量試劑盒和大腸桿菌Rosetta購于天根生化科技（北京）有限公司；質粒載體pET22b（+）購自寶生物工程（大連）有限公司。全自動化學發光分析儀（LumiRay 1260）購于深圳雷杜生命科學股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 合成目的基因 從NCBI主頁查詢Bosd5蛋白的編碼區全長序列（GenBank登錄號X14712），密碼子優化后在5'端、3'端分別添加BamH I、XhoI酶切位點，委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成目的基因序列。

1.2.2 重組表達載體構建與酶切鑒定 原核表達載體pET-22b（+）分別用限制性內切酶BamH I、XhoI雙酶切，將Bosd5基因片段與pET-22b（+）的酶切產物連接，構建重組表達質粒pET-22b（+）-Bosd5。質粒提取試劑盒提取質粒后，采用XhoI和ScaI雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產物。

1.2.3 重組蛋白的誘導表達和純化 將重組的pET-22b（+）-Bos d5轉入感受態細胞Rosetta，挑取過夜培養單菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養液中，再按1%的比例接種放大培養，在OD600為0.6時加入終濃度為0.01 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導蛋白表達，蛋白以包涵體形式存在。菌體中加入細菌裂解液和0.1 mmol /L的PMSF，用8mol /L尿素溶解處理包涵體。將裂解的包涵體溶液上樣于預先平衡好的Ni柱，然后以20 mmol /L 的咪唑緩沖液洗去雜質蛋白，最后用500 mmol /L的咪唑緩沖液對目的蛋白進行洗脫。將純化后的蛋白進行SDS-PAGE電泳，鑒定重組蛋白的表達情況。

1.2.4 重組蛋白的化學發光檢測 將重組Bosd5蛋白用Innova生物素標記試劑盒標記后，采用納米磁微粒化學發光平臺以間接法驗證重組蛋白功能。校準曲線采用全點定標，人源性IgE蛋白有7個濃度的 校 準 品：0 IU/mL（S0）、0.35 IU/mL（S1）、0.7IU/mL（S2）、3.5 IU/mL（S3）、17.5 IU/mL（S4）、50 IU/mL（S5）、100 IU/mL（S6）。第 1 步 ：加 20 μL 樣本至發光管中，再加50 μL鏈霉親和素共價偶聯而成的磁性納米顆粒，然后加入50 μL生物素標記的Bosd5，混勻，于37℃孵育15 min，形成固相抗原。第2步：清洗液清洗3次，加入135 μL堿性磷酸酶標記的抗人IgE抗體，混勻，于37℃孵育15 min形成抗原-抗體-二抗的反應模式。第3步：清洗液清洗3次，加150 μL發光底物液，37℃避光孵育5 min，化學發光檢測儀檢測光子數。納米磁微粒化學發光檢測儀檢測光子數，代入校準曲線計算出樣本中β-乳球蛋白特異性IgE抗體的含量。

1.2.5 最低檢出限 將S0作為樣本重復測定20次，S1重復測5次，算出S0重復測定濃度的平均值（M）和標準差（SD），得出M+2SD，代入S0、S1的濃度和發光值平均值擬合得出的方程，計算得到的濃度值即為最低檢出限（Limit of detection，LOD）。

1.2.6 方法學比對 收集110份臨床樣本，應用化學發光法（CLIA）和免疫熒光法（FEIA）試劑盒同時檢測臨床樣本中牛奶β-乳球蛋白sIgE抗體，以0.35IU/mL作為cut-off值［15-16］，對2種方法學的檢測結果進行陰陽性符合率、總符合率以及線性分析。

1.2.7 統計學處理 采用SPSS21.0軟件，對CLIA、FEIA檢測的牛奶過敏原β-乳球蛋白陰陽性測定值進行卡方檢驗和Kappa檢驗，檢驗水平為 0.05。

2 結果

2.1 重組表達質粒的酶切鑒定結果

將優化后的的Bosd5基因連接到pET-22b（+）表達載體后，用ScaI、XhoI雙酶切鑒定陽性克隆產物，獲得的兩個片段約為1 100 bp和5 000 bp，電泳結果與理論長度基本一致（圖1），表明表達重組質粒pET-22b（+）-Bosd5構建成功。通過對酶切成功的pET-22b（+）表達載體質粒進行雙向DNA測序，測序結果經序列比對分析表明，其序列與原始目標序列的相似性為100%，可用于后續蛋白的表達實驗。

圖1 pET-22b（+）-Bos d5限制酶切鑒定結果

2.2 重組蛋白的表達和純化結果

將pET-22b（+）-Bos d5重組質粒轉入Rosetta感受態細胞，用IPTG誘導表達，經親和純化后，SDS-PAGE凝膠電泳后如圖2顯示，在20-25 kD左右有明顯條帶，與目標大小22.5 kD大小一致，且產物純度大于85%。

圖2 重組Bos d5的SDS-PAGE圖

2.3 LoD檢測結果

經過重復測定S0樣本20次，代入S0、S1的濃度和發光值平均值擬合得出的一次方程，計算得到LOD均小于0.01 IU/mL（表1）。

2.4 方法學比對結果

將生物素化的重組蛋白制備抗體試劑盒，用于測試110份臨床樣本，并以目前國際市場上使用較多的Phadia檢測試劑盒測得的數據作參照，將重組蛋白試劑盒測得的效價測量值與Phadia檢測試劑盒測得的數據相比較。結果如圖3所示，在化學發光平臺檢測的測量值和Phadia開發的檢測試劑盒之間的線性關系為y = 0.874 1x+ 0.658 2，相關指數為R2= 0.829 9。化學發光試劑盒檢測和FEIA陽性符合率為88.9%（32/36），陰性符合率為97.3%（72/74），總 符 合 率 94.5%（104/110），P＜0.001，χ2=84.238，Kappa=0.874。由此可見本研究制備的重組蛋白試劑盒與Phadia參照試劑盒同樣具有較好的一致性。

表1 LoD測定結果

圖3 方法學比對圖

3 討論

傳統的牛奶過敏原檢測大多使用的是天然的過敏原提取物，但天然提取物存在許多缺點［17-19］：在過敏原提取中，致敏與非致敏組分均存在，會致使提取物中組分復雜，難得到高純度的單一過敏原組分；提取物中致敏原會含量不足，且含量以及活性因廠家不同使過敏原難于標準化、不具可比性，不僅不利于食物過敏原的檢測，也很難找到與特異性IgE抗體相對應的過敏原；天然過敏原提取物在加工提取和貯藏的過程中，其中固有的酶也能導致蛋白降解，導致其生物學活性降低。此外，傳統的過敏檢測不能具體區分和鑒定致敏物中的過敏原與非過敏原，對過敏原的定量十分有限。組分分析診斷（Component-resolved diagnosis，CRD）技術是基于分子診斷，使過敏原中的致敏組分分離，精確診斷出使患者產生過敏的組分，對于過敏原的精確診斷和后續的脫敏治療具有重要的意義［20-21］。

重組過敏原是過敏原新型免疫治療和診斷方法發展的基礎，重組獲得的蛋白純度和濃度高，使得自制的重組過敏原研究成本大幅度降低［22-23］。由于重組過敏原具有明確的質量、濃度和組成，批次間差異小，可重復性強，已被廣泛地應用于體外診斷試劑的研發。李建杰等［24］成功地克隆、表達了牛奶主要過敏原β-乳球蛋白的一個基因片段，經Western Blot和ELISA檢測具有較好的抗原性，能夠為后續牛奶的免疫原性研究提供參考。本研究中利用pET-22b（+）載體和目的基因構建的重組質粒經鑒定與預期大小相符，重組質粒構建成功后，經轉化、培養、誘導蛋白表達和SDS-PAGE電泳檢測顯示，獲得了高效表達的重組蛋白，為繼續開展過敏原檢測新技術研究提供基礎材料。

IgE在人體內的含量僅為IgG的1/40 000，傳統的檢測方法難以在靈敏度和特異性方面達到要求，建立高靈敏度的檢測方法尤為必要。基于高效液相色譜法、超高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法、酶聯免疫吸附法、免疫層析法、電化學免疫法、蛋白微陣列法、等離子體共振法等色譜學和免疫學方法均可用于牛奶中β-乳球蛋白的微量檢測［25-26］。食物激發試驗是大眾公認的診斷食物過敏的黃金標準，SPT（Skin prick test）提供了一種快速檢測IgE抗體的方法［27］。SPT雖然靈敏度高，但特異性較低，尚不能作為食物過敏的確診依據，更不能確診是哪種組分。SPT、食物sIgE檢測適用于速發型牛奶過敏，兩者聯合可增加診斷的準確性。隨著年齡的增長，牛奶蛋白sIgE抗體的臨界值點也相應增加，需根據患者年齡特點，選擇適宜的診斷閾值，因而一個合適的檢測方法對檢測效果有很大的影響［28］。布冠好［29］建立了定量檢測牛乳β-乳球蛋白的間接競爭ELISA方法，檢測范圍在0.05-1 μg/mL之間。ELISA技術在目前市場上已有多種針對牛奶過敏原檢測的商業試劑盒，可在短時間內實現牛奶過敏原的定性或半定量檢測，但存在線性范圍窄的缺點，不能精確定量，對后續的脫敏治療沒有很好地指導作用。賈敏等［30］建立的實時熒光定量PCR方法可應用于食品中牛奶過敏原β-乳球蛋白質的檢測，其需要對牛奶基因組DNA進行提取，步驟相對繁瑣，且不能檢測血液中的sIgE，不利于后續脫敏治療。本實驗是基于堿性磷酸酶標記技術的化學發光體系，靈敏度比RIA或ELISA大3-5個數量級，血清檢測取得了相較其他反應體系更高的陰陽性樣本比值，以及更大的線性檢測范圍，達到過敏原項目靈敏度檢測高的目的。

隨著現代科學技術的不斷發展，過敏原的檢測向高靈敏度、高準確度、高通量、操作簡單方向發展。納米磁微粒化學發光免疫診斷技術是磁微粒載體技術和化學發光檢測技術的結合，以復合材料表面標記蛋白為基礎，具有放射污染微小、自動化、檢測范圍廣、靈敏度高、準確性強、特異性強等優點［10-12］。本研究中，將制備的重組蛋白Bosd5利用生物素標記純化后，與納米磁微粒上的鏈霉親和素進行偶聯以形成固定抗原，在納米磁微粒化學發光平臺上驗證。使用重組蛋白開發的試劑盒檢測臨床樣本，靈敏度以及特異性與國外的試劑盒（Phadia的試劑盒）檢測結果的符合率較高，對比圖的線性較好，蛋白的靈敏度高、特異性強，說明制備的重組牛奶過敏原蛋白符合開發試劑盒的性能指標，可以用于后續研究和臨床檢測。

4 結論

構建牛奶過敏原Bosd5原核表達系統，表達了特異性和效價優良的重組β-乳球蛋白，β-乳球蛋白生物素化后作為規模化生產牛奶β-乳球蛋白過敏原檢測試劑盒的基礎材料，適用于全自動納米磁微粒化學發光檢測系統。