益氣養陰祛瘀方與性激素對NOD小鼠的整體療效及免疫功能的干預作用*

黃綏心 王新昌 肖麗群 吳啟富 范永升

（1.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫藥大學附屬第二醫院，浙江 杭州310005；3.南方醫科大學附屬南方醫院，廣東 廣州 510515）

干燥綜合征（SS）是一種臨床較為常見的自身免疫性疾病。益氣養陰祛瘀方是依據SS氣虛陰虧的主要病機特點組方而成，前期的研究表明，該方具有較好的臨床療效［1］。本研究在前期研究基礎上，采用益氣養陰祛瘀方和性激素治療非肥胖糖尿病自發性SS模型小鼠。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 8周齡雌性非肥胖糖尿病（NOD）小鼠60只，ICR 小鼠 10 只，體質量（20.0±2.0）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。NOD小鼠動物合格證號 SCXK （滬）2007-0005；ICR小鼠動物合格證號SCXK（滬）2008-0016。

1.2 儀器和試劑 動物電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠，型號TC3KH）；精密電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司，型號BS124S）；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒 （上海西唐生物技術有限公司，批號：1207261）；小鼠白介素-6（IL-6）ELISA 檢測試劑盒（上海西唐生物技術有限公司，批號1207251）。

1.3 藥物 益氣養陰祛瘀方組成：生地黃24 g，玄參15 g，麥冬 15 g，石斛 12 g，白芍 12 g，黃芪 24 g，丹參30 g，益母草15 g。以上藥材購自浙江中醫藥大學中藥飲片廠；脫氫表雄酮（美國Sigma公司，批號D4000）；戊酸雌二醇（拜耳醫藥保健有限公司，批號035A）；硫酸羥氯喹片（上海中西制藥有限公司，批號101106）。

1.4 分組與給藥 NOD小鼠60只，ICR小鼠10只，先適應性飼養1周，然后NOD小鼠按隨機數字表法分為6組：模型組、羥氯喹組、益氣養陰祛瘀方組（中藥組）、脫氫表雄酮（DHEA）組、雌二醇（E2）組、脫氫表雄酮加雌二醇（DHEA+E2）組，每組10只。10只ICR小鼠為正常組。正常組和模型組給生理鹽水灌胃，羥氯喹組給予羥氯喹藥液75mg/kg，中藥組給予益氣養陰祛瘀方藥液27.4 g/kg；DHEA組給予脫氫表雄酮混懸液37.5mg/kg；E2組給予雌二醇溶液 0.375mg/kg；DHEA+E2組給予DHEA 37.5mg/kg，E20.375mg/kg。 所有實驗小鼠均以0.2mL/10 g灌胃12周。

1.5 檢測指標 （1）飲水量測定。實驗開始第1日起，每日給藥前稱重并記錄各組小鼠飲水瓶質量，計算各組小鼠日均飲水量。分別在第9周末、第15周末和第20周末統計結果。計算公式：小鼠日均飲水量（g）=［前1 日全組飲水瓶質量（g）-當日全組飲水瓶質量（g）］/全組動物數。（2）唾液分泌量測定。分別在NOD小鼠第9、15和20周齡時用濕重法測各組小鼠唾液分泌量。具體方法：撿取干棉球1個，稱其干質量為M0，質量在4.5～5.0mg范圍。然后將棉球置于小鼠口頰內，并用鑷子將其固定，5min后取出，在電子天平上稱其濕質量M，（M-M0）即為小鼠唾液分泌量。（3）胸腺、脾臟和頜下腺指數測定。灌胃飼養12周后，小鼠取血后并斷頸處死，分離脾臟、胸腺和頜下腺并精確稱質量，計算小鼠脾臟指數和胸腺指數。（4）小鼠血清細胞因子檢測。小鼠取血后，將血漿置于室溫中30min以上，以3000 r/min離心15min，分離血清，凍存于-80℃超低溫冰箱。采用ELISA法測定血清中TNF-α、IL-6，按照試劑盒說明書操作，繪制標準曲線，讀取樣本含量。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s）表示，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠每日飲水量比較 見表1。第9周末，NOD各組小鼠每日飲水量相近（P＞0.05），但高于正常組（P＜0.05）。第15周末時，除中藥組外，各給藥組飲水量均較模型組和同組第9周末時減少（P＜0.05）；DHEA組比羥氯喹組、E2組和DHEA+E2組更低 （P＜0.05）；且與正常組比較無顯著差異（P＞0.05）。第 20周末時，各給藥組飲水量均較第15周末時進一步減少（P＜0.05）；與正常組比較，羥氯喹組、E2組和 DHEA+E2組的飲水量仍偏高（P＜0.05）。9周齡時，與正常組比較，中藥組小鼠每日飲水量更高（P＜0.05）。15周齡時，中藥組每日飲水量較模型組和9周齡時明顯減少（P＜0.05），與正常組比較無顯著差異（P＞0.05）。 20周齡時，中藥組飲水量較第15周末時略有減少，且明顯低于羥氯喹組（P＜0.05）。

表1 各組小鼠每日飲水量比較（g，±s）

表1 各組小鼠每日飲水量比較（g，±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與 DHEA組比較，★P＜0.05；與本組 9 周齡比較，■P＜0.05。 下同。

第9周末 第15周末4.21±0.32 4.26±0.24△6.38±0.44*6.55±0.43*6.63±0.40* 5.07±0.62*△★■DHEA 組 10 4.25±0.63△■組 別 n 第20周末正常組 10 4.18±0.35△模型組 10 6.72±0.68*羥氯喹組 10 4.96±0.57*△★■6.56±0.60* 4.35±0.55△■E2組 10 6.53±0.46* 5.18±0.53*△★■ 4.98±0.58*△★■DHEA+E2組 10 6.57±0.58* 5.03±0.61*△★■ 4.91±0.49*△★■中藥組 10 6.61±0.53* 4.69±0.58△■ 4.32±0.55△■

2.2 各組小鼠唾液分泌量比較 見表2。與正常組比較，模型組小鼠唾液分泌量明顯減少（P＜0.05）。第9周末時，NOD各組唾液分泌量相近（P＞0.05），且明顯低于正常組（P＜0.05）。第15周末時，各給藥組唾液分泌量比模型組明顯增加（P＜0.05）；DHEA組唾液分泌量更高于羥氯喹組、E2組和本組第9周末（P＜0.05）。第20周末時，各給藥組小鼠唾液分泌量較15周末時稍有減少，但仍比模型組分泌量高（P＜0.05）；羥氯喹組、E2組、DHEA+E2組與同組 9 周末相近 （P＞0.05），與DHEA組比較，DHEA+E2組分泌量與其有顯著差異（P＜0.05）。

表2 各組小鼠唾液分泌量比較（mg，±s）

表2 各組小鼠唾液分泌量比較（mg，±s）

第9周末 第15周末6.60±0.36△ 6.79±0.28△4.05±0.33*3.72±0.36*4.13±0.40* 4.54±0.33*△★DHEA 組 10 5.58±0.29*△■組 別 n 第20周末正常組 10 6.69±0.32模型組 10 3.71±0.18*羥氯喹組 10 4.49±0.37*△★4.06±0.30* 5.78±0.23*△■E2組 10 4.13±0.36* 4.52±0.26*△★ 4.47±0.25*△★DHEA+E2組 10 4.07±0.28*4.91±0.39*△ 4.77±0.38*△★中藥組 10 4.11±0.33* 5.70±0.33*△■ 5.63±0.31*△■

9周齡時，中藥組小鼠唾液分泌量低于正常組（P＜0.05）。15周齡時，中藥組唾液分泌量較9周末時增加明顯，并顯著高于模型組（P＜0.05）；與羥氯喹組比較，中藥組唾液分泌量更高（P＜0.05）。20周齡時，中藥組唾液分泌量較15周末時略有減少，但仍高于模型組與羥氯喹組（P＜0.05）。

2.3 各組小鼠胸腺、脾臟和頜下腺指數比較 見表3。與正常組比較，各組小鼠脾臟指數均升高（P＜0.05）；與模型組比較，羥氯喹組、DHEA組、中藥組明顯低于模型組（P＜0.05）；E2組、DHEA+E2組雖低于模型組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與正常組比較，NOD各組胸腺指數均降低 （P＜0.05），與模型組比較，DHEA組胸腺指數增高明顯 （P＜0.05）；而羥氯喹組、E2組、DHEA+E2組與模型組相近（P＞0.05）。與正常組比較，NOD各組小鼠頜下腺指數均降低，其中羥氯喹組、E2組和DHEA+E2組更低 （P＜0.05）；DHEA組與正常組相近（P＞0.05），且高于模型組、羥氯喹組和 E2組（P＜0.05）。與正常組比較，中藥組胸腺指數仍偏低 （P＜0.05），但高于模型組和羥氯喹組（P＜0.05）。中藥組小鼠頜下腺指數與正常組相近（P＞0.05），但顯著高于羥氯喹組（P＜0.05）。

表3 各組小鼠胸腺、脾臟和頜下腺指數比較（mg/g，±s）

表3 各組小鼠胸腺、脾臟和頜下腺指數比較（mg/g，±s）

脾臟指數 胸腺指數3.02±0.34△ 1.68±0.15△4.08±0.29* 1.06±0.11*3.46±0.38△ 1.21±0.19*DHEA 組 10 0.69±0.13△★■組 別 n 頜下腺指數正常組 10 0.77±0.21△模型組 10 0.40±0.05*羥氯喹組 10 0.44±0.06*3.44±0.24△ 1.52±0.12△E2組 10 3.91±0.37* 1.22±0.11* 0.49±0.08*DHEA+E2組 10 3.83±0.20* 1.26±0.12* 0.53±0.10*中藥組 10 3.52±0.45 1.45±0.15 0.66±0.08

2.4 各組小鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 見表4。NOD各組小鼠血清TNF-α、IL-6水平均明顯高于正常組（P＜0.05）；與模型組比較，羥氯喹組、DHEA 組和DHEA+E2組 TNF-α、IL-6 水平均降低明顯（P＜0.05）。中藥組小鼠血清TNF-α、IL-6水平較模型組明顯下降（P＜0.05），比羥氯喹組降低更為明顯（P＜0.05）；與正常組比較，中藥組血清TNF-α、IL-6水平仍偏高（P＜0.05）。

表 4 各組小鼠血清 TNF-α、IL-6 水平比較（mg/g，±s）

表 4 各組小鼠血清 TNF-α、IL-6 水平比較（mg/g，±s）

TNF-α IL-6 107.07±16.22△ 15.56±1.52△296.54±22.68* 34.62±6.42*230.95±17.98△ 25.59±3.15*DHEA 組 10 238.53±15.13△ 25.58±3.40△E2組 10 269.87±18.26* 29.47±4.16*DHEA+E2組 10 244.38±16.28* 27.83±5.65*中藥組 10 193.61±12.32* 21.32±4.09*組 別 n正常組 10模型組 10羥氯喹組 10

3 討 論

SS患者臨床上常因涎腺和淚腺功能下降而出現口干、眼干癥狀，并伴有多器官、多系統的損害［2］；其免疫病理本質是在遺傳缺陷的基礎上，局部非特異性感染導致局部和全身的免疫反應，進一步引發免疫機制的紊亂、炎癥遷延，最終使得唾液腺、淚腺等外分泌腺受損，大量淋巴細胞、漿細胞及單核細胞浸潤，腺管狹窄、萎縮和纖維化，從而導致唾液、淚液分泌減少出現口干渴、眼干癥狀［3］。

本研究采用的NOD小鼠是近年來實驗研究應用較多的動物模型，其表現與人類SS相似，是動物實驗研究SS 較為理想的模型［4-7］。

目前對SS尚無根治的療法，臨床主要應用的免疫抑制劑和糖皮質激素長期使用副作用較多。中醫認為本病為先天稟賦不足，素體五臟羸弱，致氣血不足而發病；先天陰精虧虛，津液生成減少，臟腑經絡、筋骨百骸、四肢孔竅無以濡養而燥癥外現。故本病辨證為氣虛陰虧兼夾血瘀為本，燥熱為標，治療總則為益氣養陰祛瘀。依此以黃芪、生地黃、玄參、麥冬、石斛、白芍、丹參、益母草等制方進行治療。多數學者認為性激素在SS的發生、發展中應該起著重要作用，但調控機制和途徑尚未能有明確的闡釋［8］。本課題組前期研究發現［9］，益氣養陰祛瘀方對SS患者外周血雌、雄激素水平有較好的調整作用。

本研究應用益氣養陰祛瘀方和性激素治療NOD小鼠，從飲水量、唾液分泌量、胸腺、脾臟和頜下腺指數以及血清細胞因子等方面觀察治療作用，結果顯示，益氣養陰祛瘀方和DHEA可通過改善頜下腺的病理狀態而緩解口干癥狀；DHEA提高唾液分泌量、改善口干的作用明顯。

脾臟和胸腺均是機體內重要的免疫器官。通過檢測胸腺指數和脾臟指數可以評價免疫器官的形態發育和免疫功能的狀態。益氣養陰祛瘀方和DHEA能改善脾臟指數和胸腺指數，抑制腺體萎縮，而達到調節機體免疫功能的作用。

研究已證實，SS外分泌腺的損害與淋巴細胞浸潤及其中的細胞因子水平關系密切。由于多數浸潤淋巴細胞為T細胞，因此T細胞被視為SS外分泌腺受損的關鍵因素。實驗結果顯示，NOD小鼠血清Th1型細胞因子TNF-α和Th2型細胞因子IL-6水平均較正常組明顯增高，表明NOD小鼠存在高水平的Th1、Th2型細胞因子。應用益氣養陰祛瘀中藥和DHEA后，小鼠血清TNF-α、IL-6水平較模型組降低，表明益氣養陰祛瘀中藥和DHEA能降低血清TNF-α、IL-6水平，調節NOD小鼠免疫功能。

益氣養陰祛瘀方和DHEA對NOD小鼠均有良好的療效及改善免疫功能的作用，表明益氣養陰祛瘀方具有類雄激素樣的治療作用。E2的治療作用在本研究中未得到體現，可能是與實驗的研究內容側重于對唾液腺治療觀察有關，因此益氣養陰祛瘀方與E2在治療方面的比較是需要今后進一步探討的問題。另外，筆者發現DHEA在合用E2后，其治療作用均較單用DHEA療效降低，原因是雄雌激素用藥比例的問題抑或是存在不同的信號途徑，其確切機理尚待深入研究。

［1］ 王新昌，謝志軍，溫成平，等.益氣養陰祛瘀法治療原發性SS 的療效觀察［J］.中國基層醫藥，2009，16（1）：92-95.

［2］ 中華醫學會風濕病學分會.SS診治指南（草案）［J］.中華風濕病學雜志，2003，7（7）：446-448.

［3］ 顏淑敏，曾小峰.原發性SS診治進展［J］.實用醫院臨床雜志，2007，4（3）：6-8.

［4］ Szodoray P，Jonsson R.The BAFF/APRIL system in systemic autoimmune disease with a special emphasis on Sjogren′s syndrome［J］.Scand JImmunol，2005，62（3）：421-428.

［5］ Yamamoto H，Sims NE，Macauley SP，etal.Alterrations in the secretory responseofnon-obese diabetic（NOD）mice tomuscarinic receptor stimulation［J］.Clin Immunol Immunopathol，1996，78（2）：245-255.

［6］ Humphreys-Beher MG，Hu Y，Nakagawa Y，et al.Utilization of thenonobese diabetic（NOD） mouse as an animalmodel for the study of secondary Sjogren′s syndrome［J］.Adv Exp Med Biol，1994，350（5）：631-636.

［7］ Yarnano S，Atkinson JC，Baum BJ，etal.Salivary gland cytokine gene expression in NOD and BALB/Cmice［J］.Autoimmunity，1999，92（2）：265-275.

［8］ Laine M，et al.Segment-specific but pathologic laminin isoform profiles in human labial salivary glands of patients with Sj¨ogren’ssyndrome［J］.ArthritisRheum，2004，50（12）：3968-3973.

［9］ 王新昌，謝志軍，溫成平，等.益氣養陰祛瘀藥對SS患者性激素水平影響的研究［J］.浙江中醫藥大學學報，2009（1）：48-50.