5味中藥醇提物對尼羅羅非魚白細胞免疫活性的作用

程 敏，李忠琴，翟少偉，賴曉健，楊求華，江興龍

( 1.集美大學 水產學院，福建 廈門 361021； 2.鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心，福建 廈門 361021； 3.廈門市漁用藥物工程技術研究中心，福建 廈門 361021； 4.福建省水產研究所，福建 廈門 361021 )

隨著科技的發展與生活質量的提高，水產養殖持續發展，水產養殖規模不斷擴大。環境污染和全球變暖等問題的出現，使水產動物病害的潛在風險受到廣大研究者的關注。許多中草藥都具有提高生物機體的非特異性免疫力的作用，如提高白細胞呼吸爆發活性和吞噬活性，進而能夠增強生物體抵抗病原侵害的能力，能夠有效的預防疾病的發生，而且中草藥屬于綠色天然植物，具有污染小、來源豐富、功能多樣等優點，同時中草藥如連翹、黃芪、黃連等對于增強動物體免疫能力亦具有突出作用[1-2]。中草藥在水產養殖病害防控中具有廣泛應用前景，如孟彬等[3]的試驗結果顯示，發酵中草藥在水產養殖中具有明顯優勢；中草藥添加劑提高了水產品的質量，減少了化學藥物殘留[4-6]。因此，中草藥添加劑備受水產養殖業者的關注。筆者以尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)為研究對象，采用尼羅羅非魚離體外周血白細胞與中草藥提取液共孵育的方法，檢測共孵育后中草藥提取液對白細胞呼吸爆發活性和吞噬活性的影響，考察多種中草藥對尼羅羅非魚免疫細胞激活效果，篩選出適合尼羅羅非魚養殖使用的天然免疫增強劑[7-11]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

尼羅羅非魚：試驗魚均為養殖場養殖14 d以上的尼羅羅非魚。

中草藥：五倍子、白頭翁、地榆、柯子、虎杖。

儀器：酶標儀(MULTISKAN GO、Thermo SCIENTIFIC)、流式細胞儀(CytoFLEX、貝克曼庫爾特)、超微粉碎機(SQW-601山東三清不銹鋼設備有限公司)、生化培養箱(LRH-250、上海一恒科技學儀器有限公司)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 主要試驗試劑及配制方法

Percoll細胞分離液、二甲基亞砜分析純、臺盼藍染液、L-15細胞培養液。

磷酸緩沖鹽溶液：用蒸餾水依次稀釋Na2HPO41.07 g，KH2PO40.398 g和NaCl 8.5 g，偶用稀鹽酸溶液調節pH至7.2～7.4，然后用容量瓶定容至1000 mL，分裝后放置高壓滅菌鍋中，121 ℃下，高溫高壓滅菌20 min，滅菌結束后放置于冰箱中4 ℃保存。

抗凝劑：用已滅菌的磷酸緩沖鹽溶液將肝素鈉稀釋成3000 U/mL，用0.2 μm過濾器過濾后，置于4 ℃冰箱中保存。

0.2% NBT：將20 mg NBT加入10 mL已經滅菌的磷酸緩沖鹽溶液中溶解，置于冰箱中4 ℃避光保存。

2 mol KOH:用已滅菌的去離子水稀釋11.2 g KOH固體，然后用容量瓶定容至100 mL，置于冰箱中4 ℃保存。

70%甲醇水溶液：用滅菌的去離子水稀釋，70 mL甲醇加入30 mL滅菌的去離子水中，置于冰箱中4 ℃保存。

5%二甲基亞砜溶液：用滅菌的磷酸緩沖鹽溶液配制,5 mL二甲基亞砜加入95 mL磷酸緩沖鹽溶液，置于冰箱4 ℃保存。

熒光微球懸液的制備：將標準微球懸液用滅菌的磷酸緩沖鹽溶液稀釋成密度為1×105個/mL的微球懸液。

70%乙醇溶液：用蒸餾水與95%的乙醇混合制備。

1.2.2 中草藥提取液的制備[12]

中藥的超微粉碎：將所選的中草藥用中藥粉碎機粉碎至約100目，將粉碎的藥粉放入超微粉碎機進一步粉碎后，收集超微藥粉備用。

中草藥提取物樣品制備：將收集的超微藥粉過160目篩后，收集藥粉，按照料液比1∶10的比例將藥粉與60%的乙醇水溶液混合，用超聲波粉碎機超聲1 h，用濾紙過濾后收集濾液，將濾液置于多樣品平行蒸發儀中濃縮后制得中藥提取物，將中藥提取物置于4 ℃環境下保存。

稱取1.00 g的單味中草藥提取物，置于15 mL離心管，加10 mL 5%二甲基亞砜溶液后混勻。在恒溫振蕩儀中浸泡提取72 h，用離心機2500 r/min下離心10 min，用0.2 μm的無菌濾膜過濾上清液，制成質量濃度為0.1 mg/mL的藥液。依照此方法制備不同質量濃度梯度試驗藥液。

1.2.3 雙聯用藥液配制

依據5種中草藥提取液的最低抑菌質量濃度(MIC)[13]，分別將兩種中草藥的藥液等體積混合，藥液質量濃度配比見表1，依照中草藥單用方法進行操作。其中藥物組合(A+B)分別為：Ⅰ，五倍子+白頭翁；Ⅱ，五倍子+地榆；Ⅲ，五倍子+柯子；Ⅳ，五倍子+虎杖；Ⅴ，白頭翁+地榆；Ⅵ，白頭翁+柯子；Ⅶ，白頭翁+虎杖；Ⅷ，地榆+柯子；Ⅸ，地榆+虎杖；Ⅹ，柯子+虎杖。

表1 中草藥雙聯用質量濃度配比Tab.1 Concentration proportion of Chinese herbal medicine for dual-prescription

1.2.4 尼羅羅非魚血漿的制備[14]

取經14 d暫養的尼羅羅非魚，在1 L水體加入0.05 mL丁香酚進行麻醉，用無菌注射器吸取0.2 mL抗凝劑，自魚尾靜脈采血0.5 mL,將魚血與L-15細胞培養基按體積比1∶9的比例混合，制成尼羅羅非魚血漿。

1.2.5 外周血白細胞的分離制備[15-16]

將無菌生理鹽水和Percoll細胞分離液按照不同的比例混合，制成70%、60%、50%、40%、30%的細胞分離混合液。每種比例的混合液設3個平行組，選擇最合適的Percoll細胞分離混合液分離制備尼羅羅非魚白細胞樣品。

1.2.6 尼羅羅非魚外周血白細胞呼吸爆發試驗[17]

取一塊96微孔板，將每一行設為一組，1～3孔為L組，4～6孔為N組，第一行為空白對照組，其余各行為中草藥提取液試驗組。(1)每孔加入白細胞懸液100 μL。(2)試驗組每孔加入100 μL的中草藥提取液，空白對照組每孔加入100 μL的5%二甲基亞砜溶液，然后用磷酸緩沖鹽溶液將每孔補齊到300 μL。在室溫下孵育2 h，然后將每孔的上清液吸去100 μL，再用100 μL的L-15細胞培養基洗滌3次。(3)向每行的1～3孔加入50 μL的L-15細胞培養基，每行的4～6孔各加入50 μL的L-15細胞培養液和0.2% NBT溶液，再用磷酸緩沖鹽溶液將每孔補齊到300 μL。置于室溫下孵育1 h，然后將每孔的上清液吸去100 μL，再加入100 μL的甲醇固定3 min，然后再去除100 μL的上清液，再用100 μL的70%甲醇溶液清洗3次。接著輕輕的吹去每孔的液體，在室溫下風干后，在每孔中加入100 μL的2 mol KOH溶液和200 μL 100%二甲基亞砜，然后用全波長酶標儀測定波長630 nm下各孔的吸光值(OD)。

1.2.7 尼羅羅非魚外周血白細胞吞噬試驗[18-19]

試驗組：將200 μL白細胞懸液分裝于已滅菌的1.5 mL離心管中，加入100 μL中草藥提取液，常溫下共孵育2 h，之后加入50 μL微球懸液，混勻后常溫下避光反應，1 h后加入250 μL 70%甲醇固定，終止反應，然后依次進樣，采用流式細胞儀檢測。

對照組：將200 μL白細胞懸液分裝于已滅菌的1.5 mL離心管中，加入100 μL 5%二甲基亞砜，常溫下共孵育2 h，之后加入50 μL微球懸液，混勻后常溫下避光反應，1 h后加入250 μL 70%甲醇固定，終止反應，然后依次進樣，采用流式細胞儀檢測。

1.2.8 白細胞呼吸爆發及吞噬率的計算公式

呼吸爆發活性=ODN-ODL

呼吸爆發增加率/%=(m1-m)/m×100%

細胞吞噬率/%=n1/n×100%

細胞吞噬增加率/%=(f1-f)/f×100%

呼吸爆發聯用指數=[(A2-A1)+(B2-B1)]/(A1+B1)

吞噬聯用指數=[(A4-A3)+(B4-B3)]/(A3+B3)

式中，ODN為N孔的吸光值，ODL為L孔的吸光值；m1為試驗組呼吸爆發活性，m為空白對照組呼吸爆發活性；n1為參與吞噬的細胞數，n為血細胞總數；f1為試驗組細胞吞噬率，f為對照組細胞吞噬率；A1為A藥單用呼吸爆發增加率，A2為A藥聯用呼吸爆發增加率，B1為B藥單用呼吸爆發增加率，B2為B藥聯用呼吸爆發增加率；A3為A藥單用吞噬增加率，A4為A藥聯用吞噬增加率，B3為B藥單用吞噬增加率，B4為B藥聯用吞噬增加率。

2 結果與分析

2.1 外周血白細胞分離液的比例優化

因為白細胞分離試驗是后續試驗的鋪墊，要求其有較高的準確性，所以對于這個部分的試驗進行了多次重復，以確定準確性，對不同比例的Percoll細胞分離混合液的分離效果的研究表明，30%的Percoll細胞分離混合液分離的效果最好，獲得的白細胞密度最高，密度達107cfu/mL(表2)。

表2 外周血白細胞的分離液比例優化Tab.2 Proportion optimization of leukocytes and percoll cell separation mixture

2.2 外周血白細胞呼吸爆發活性的測定

2.2.1 5味中草藥單用對白細胞呼吸爆發活性的影響

5味中草藥提取液與尼羅羅非魚外周血白細胞共孵育的研究結果顯示，當五倍子、白頭翁、地榆、柯子、虎杖的質量濃度分別為0.5、50、1.5、1.5、2.0 mg/mL時，白細胞呼吸爆發活性值最高，其白細胞呼吸爆發活性增加率分別為128.68%、123.96%、28.37%、44.44%、78.93%。由試驗結果可知，以上幾味中草藥提取液的白細胞呼吸爆發活性值均顯著高于其對照組，表明這5味中草藥均可顯著提高尼羅羅非魚外周血白細胞的呼吸爆發活性。單用組間差異分析得出白細胞呼吸爆發活性在五倍子與柯子，虎杖與柯子具有顯著性；呼吸爆發活性增加率在五倍子與地榆、五倍子與柯子、五倍子與虎杖、白頭翁與地榆、白頭翁與柯子、白頭翁與虎杖具有顯著性(圖1、2)。

圖1 5味中草藥提取物單用的白細胞呼吸爆發活性Fig.1 Respiratory burst activity leukocytes of during treatement with five Chinese herbal extracts

圖2 5味中草藥提取物單用的白細胞呼吸爆發活性增加率Fig.2 Increase rate in respiratory burst activity in leukocytes during treatment with five Chinese herbal extracts不同字母表示具有顯著性差異，相同字母表示無顯著性差異，下同.Means with different letters are significant difference, and means with same letter are not significant difference, et sequentia.

2.2.2 5味中草藥雙聯用對白細胞呼吸爆發活性的影響

根據尼羅羅非魚外周血白細胞呼吸爆發試驗單用的結果，將上述中草藥提取液進行雙聯用(最低抑菌質量濃度)，試驗結果顯示，當五倍子∶白頭翁的質量濃度比例為2.0∶2.0、五倍子∶地榆的質量濃度比例為0.5∶2.0、五倍子∶柯子的質量濃度比例為0.5∶1.0、五倍子∶虎杖的質量濃度比例為2.0∶0.5、白頭翁∶地榆的質量濃度比例為2.0∶2.0、白頭翁∶柯子的質量濃度比例為2.0∶2.0、白頭翁∶虎杖的質量濃度比例為0.5∶1.0、地榆∶柯子的質量濃度比例為2.0∶2.0、地榆∶虎杖的質量濃度比例為1.0∶2.0、柯子∶虎杖的質量濃度比例為0.5∶1.0時，白細胞呼吸爆發活性最高，其呼吸爆發活性增加率分別為138.93%、108.53%、58.70%、64.29%、106.55%、79.85%、115.17%、84.15%、63.76%、79.01%。呼吸雙聯用各組間顯著性分析得出，質量濃度對白細胞免疫活性的作用的影響較小，不同中藥對白細胞免疫活性的作用的影響較大，差異顯著(表3、圖3)。

表3 中草藥提取物雙聯用的白細胞呼吸爆發活性增加率 %Tab.3 The increase rate in respiratory burst activity in leukocytes during treatment with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

尼羅羅非魚外周血白細胞呼吸爆發試驗單用與雙聯用試驗中白頭翁+地榆、白頭翁+柯子、白頭翁+虎杖、地榆+柯子、柯子+虎杖5組的聯用指數分別為1.28、0.10、0.51、0.54、0.02，其中，白頭翁+地榆表現出其顯著的協同作用(表4、圖4)。

2.3 外周血白細胞吞噬活性的分析

2.3.1 5味中草藥單用對白細胞吞噬活性的影響

對上述篩選的單獨使用可顯著提高尼羅羅非魚外周血白細胞呼吸爆發活性的5味中草藥，進一步測定其對外周血白細胞吞噬活性的影響，再采用流式細胞儀技術檢測白細胞吞噬率。試驗結果表明，當五倍子、白頭翁、地榆、柯子、虎杖的質量濃度分別為0.125、25.0、1.5、1.5、0.5 mg/mL、時，均能顯著提高尼羅羅非魚外周血白細胞的吞噬活性(圖5)，吞噬率較對照組分別增加了44.04%、44.66%、95.00%、10.35%、64.93%，之后隨地榆、柯子、五倍子、虎杖4種中草藥的質量濃度增加，吞噬率下降，甚至出現抑制；而當白頭翁質量濃度增加時，吞噬率趨于平穩。而組間的吞噬效果沒有明顯差異。

圖3 雙聯用呼吸爆發活性增加率及顯著性分析Fig.3 The increase rate and significance of respiratory burst activity in leukocytes during treatment with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

表45味中草藥雙聯用的呼吸爆發聯用指數

Tab.4 Combination index of respiratory burst index during treatment with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

圖4 5味中草藥單用和雙聯用呼吸爆發增加率對比Fig.4 Comparison of increase rate in respiratory burst activity in leukocytes between treatment with single and dual-prescription of five Chinese herbal extracts

2.3.2 5味中草藥雙聯用對白細胞吞噬活性的影響

依照尼羅羅非魚外周血白細胞吞噬活性試驗單用的結果，將上述中草藥提取液進行雙聯用，試驗結果顯示，當五倍子∶白頭翁的質量濃度比例為0.5∶1.0、五倍子∶地榆的質量濃度比例為0.5∶1.0、五倍子∶柯子的質量濃度比例為0.5∶1.0、五倍子∶虎杖的質量濃度比例為0.5∶0.5、白頭翁∶地榆的質量濃度比例為2.0∶1.0、白頭翁∶柯子的質量濃度比例為2.0∶1.0、白頭翁∶虎杖的質量濃度比例為2.0∶1.0、地榆∶柯子的質量濃度比例為1.0∶1.0、地榆∶虎杖的質量濃度比例為0.5∶0.5、柯子∶虎杖的質量濃度比例為1.0∶0.5時，吞噬增加率最高，分別為45.96%、58.53%、38.83%、23.84%、59.48%、62.85%、92.27%、59.70%、86.27%、69.22%。吞噬雙聯用各組間顯著性分析得出，質量濃度對白細胞吞噬增加率的作用的影響較小，不同中藥對白細胞吞噬增加率作用的影響較大，差異顯著(表5、圖6)。

圖5 白細胞與中藥共孵育后吞噬活性增加率Fig.5 Increase rate in phagocytic activity in leukocytes treated with five Chinese herbal extracts

尼羅羅非魚外周血白細胞吞噬活性單用與雙聯用試驗中，五倍子+白頭翁、五倍子+柯子、五倍子+虎杖、白頭翁+柯子、白頭翁+虎杖、地榆+柯子、地榆+虎杖、柯子+虎杖8組的細胞吞噬聯用指數分別是0.90、0.78、3.03、1.06、11.45、0.13、0.28、6.20，其中五倍子+虎杖、白頭翁+柯子、白頭翁+虎杖、柯子+虎杖表現出顯著的協同作用(表6、圖7)。

表5 5味中草藥雙聯用的白細胞吞噬力增加率 %Tab.5 Increase rate in phagocytosis in leukocytes treated with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

圖6 5味中草藥雙聯用的白細胞吞噬力比較Fig.6 Comparison of phagocytosis in leukocytes treated with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

表6 五味中草藥雙聯用的吞噬聯用指數Tab.6 Combination of phagocytosis index during treatment with dual-prescription of five Chinese herbal extracts

3 討 論

3.1 細胞分離液對外周血白細胞分離效果的影響

不同品種的魚類，其血細胞的構成和血液指數也會不同，因此，對于不同品種的魚，Percoll細胞分離混合液分離的條件也會不同。已有研究發現，當

圖7 5味中草藥單用和雙聯用吞噬增加率對比Fig.7 Comparison of the increase rate of phagocytic activity in leukocytes treated with single and dual-prescription of five Chinese herbal extracts

分離液的密度為1.080～1.085時，可將草魚(Ctenopharyngodonidellus)和鯉魚(Cyprinuscarpio)外周血白細胞有效的分離出來[20]，本試驗研究結果表明，30%的Percoll細胞分離混合液的分離效果最好，與草魚和鯉魚的細胞分離液密度較為接近[21]。

3.2 白細胞吞噬活性測定方法的建立

經過對比幾種測定白細胞吞噬的方法發現，流式細胞儀技術相對于傳統的技術而言，具有顯著的優勢，如測定的準確性高、重復性好且操作簡單。顯微鏡鏡檢法通過對細胞的染色，可直接用肉眼在顯微鏡下觀察細胞的形態特征及細胞吞噬現象。通過這種方法也確實獲得了許多關于細胞形態及功能的信息，但是鏡檢法也存在許多缺點，如重復性差和主觀性強等問題。而相比較而言，流式細胞儀技術就能很好地解決這種主觀性問題,不僅測定準確性高、重復性好且操作簡單快捷，因此本試驗最終以流式細胞儀技術為檢測方法[22]。

3.3 中草藥增強白細胞免疫活性的分析

隨著水產養殖的持續發展，人們已經將水產病害防治研究的目光轉向了中草藥這種即安全又高效的藥物。本研究以尼羅羅非魚為對象，結合5味中草藥的提取液，再利用氮藍四唑還原法和流式細胞儀技術分別檢測這5味中草藥提取液對尼羅羅非魚血清免疫細胞的影響，初步篩選出能夠提高尼羅羅非魚非特異性免疫能力的中草藥免疫增強劑。通過對以上5種中草藥兩兩聯用后，在氧呼吸爆發雙聯用試驗中，表現出協同作用的有白頭翁+地榆、地榆+柯子、白頭翁+虎杖，在吞噬雙聯用試驗中，表現出協同作用的有五倍子+白頭翁、白頭翁+虎杖、柯子+虎杖。

相比較本試驗的方法而言，以往的研究主要是采用拌料投喂的方式進行，這種方式不僅耗時久，而且不適合快速篩選大量的樣品[23]。而本試驗采用離體外周血白細胞與中草藥提取液共孵育的方法，快速檢測這5味中草藥對尼羅羅非魚血清免疫細胞的影響，這種方法具有篩選成本低，篩選速度快等優點，而且很適合對大量的樣品進行快速篩選[24]。

4 結 論

通過建立離體尼羅羅非魚外周血白細胞與中草藥提取液共孵育的方法，再結合流式細胞儀技術對白細胞呼吸爆發活性和吞噬活性的影響進行檢測，單用試驗結果顯示，五倍子、白頭翁、地榆、柯子和虎杖5味中草藥均能顯著增強尼羅羅非魚外周血白細胞的呼吸爆發活性和吞噬活性。呼吸爆發活性試驗結果顯示，在最適的質量濃度下，5味中草藥提取液的白細胞呼吸爆發活性值均顯著高于其對照組，均可以顯著提高尼羅羅非魚外周血白細胞的呼吸爆發活性，其呼吸爆發活性增加率為五倍子>白頭翁>虎杖>柯子>地榆。吞噬活性試驗結果顯示，在最適質量濃度下，5味中草藥吞噬率均優于對照組，其提高吞噬率效果為地榆>虎杖>白頭翁>五倍子>柯子。

5味中草藥雙聯用的研究結果表明，在呼吸爆發活性雙聯用試驗組合中表現明顯協同作用，且活性為白頭翁+地榆>白頭翁+虎杖；在吞噬活性雙聯用試驗組合中表現明顯協同作用，且活性為白頭翁+虎杖>柯子+虎杖>五倍子+虎杖>白頭翁+柯子。

綜合呼吸爆發活性和吞噬活性的試驗結果，可白頭翁+虎杖選擇組合開發成漁藥，能顯著提高養殖尼羅羅非魚血漿白細胞免疫活性，進而提高其抗病力。本研究可為此5味中草藥在水產養殖防病上的應用提供科學理論依據。