MTHFR基因多態性及血漿Hcy水平在腦卒中診斷中的臨床應用

鄧愛鳳，梁麗萍，張光輝

深圳恒生醫院檢驗科，廣東 深圳 510180

腦卒中是一種腦血管意外，又稱中風，是由遺傳因素及環境因素等多種誘發因素所共同作用導致的一種永久性的腦功能障礙，臨床表現為腦部供血受阻，導致患者腦部動脈狹窄、閉塞、破裂，引發急性腦血壓循環異常，臨床上具有較高的發病率、病殘率及病死率[1-2]。根據相關臨床資料顯示，中國腦卒中患者病死率為58/10萬～142/10萬，是導致人類死亡的三大死因之一，嚴重影響人們的生命健康[3]。因此，對腦卒中病因的研究以及預防成為臨床治療研究的重點。根據臨床研究顯示，腦卒中的發病與高同型半胱氨酸 (Hcy) 血癥密切相關，是引發腦卒中的獨立性危險因素[4]。葉酸、維生素B12或維生素B6攝入量過少或代謝過程中酶或因子發生異常，易引發高Hcy 血癥。影響高Hcy 血癥的眾多因素中較為重要的代謝關鍵酶是N5、N10亞甲基四氫葉酸還原酶 (MTHFR) ，MTHFR 多基因多態性對酶的特異活性作用很大，當MTHFR基因突變時，導致MTHFR酶活性降低，使Hcy濃度升高及DNA 低甲基化，從而導致輕度或中度高Hcy血癥，引發多種疾病[5-6]。本文回顧性分析腦卒中患者中血漿MTHFR基因多態性及HCY、葉酸、維生素B12水平的變化，并探討其對腦卒中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年6 月至2019 年6 月在深圳恒生醫院接受治療且符合腦卒中臨床診斷標準的患者300 例作為觀察組，其中缺血性腦卒中181例，出血性腦卒中119 例；另選擇同期體檢健康者300例作為對照組。納入標準：①腦卒中患者均符合中國急性缺血性腦卒中診治指南標準，并經CT 或MRI 檢查確診；正常健康體檢者均符合無血緣關系且無其他腦梗死或腦血管疾病癥狀；②近期 (1個月內) 無感染癥狀且未使用影響血漿Hcy水平的藥物，如甲氨蝶呤、葉酸以及B族維生素類代謝等；③無占位性病變者。排除標準：①合并冠心病、糖尿病等疾病者；②具有心源性腦栓塞、肝腎功能嚴重不全及惡性腫瘤等疾病者；③甲狀腺功能損傷、免疫性疾病或血液系統疾病者；④具有長時間貧血史或胃潰瘍病史者。兩組受檢者的一般資料比較差異均無統計學意義 (P＞0.05) ，具有可比性，見表1。

表1 兩組患者的基本資料比較[例 (%) ]

1.2 觀察指標 (1) 兩組受檢者的血漿Hcy水平、葉酸、維生素B12水平及收縮壓、舒張壓、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白 (LDL) 、高密度脂蛋白 (HDL) 等指標； (2) 兩組受檢者的血漿MTHFR 基因多態性分型以及不同基因分型者的血漿Hcy水平； (3) 兩組受檢者血漿MTHFR基因型及等位基因頻率分布情況。

1.3 檢測方法

1.3.1 血漿Hcy、葉酸、維生素B12水平測定 循環酶法測定Hcy，取所有受檢者空腹靜脈血5 mL，采血須一次成功，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，抗凝處理10 min 后，采用2%乙二胺四乙酸二鈉100 μL 進行分離，4℃3 000 r/min 離心分離上層血漿，標本置于-70℃環境保存待測；檢測儀器采用日本Hitch 7080全自動生化分析儀，德國西門子公司提供的相關試劑盒，根據操作說明測定Hcy水平；采用德國西門子公司ADVIA Centaur XP 全自動免疫分析儀及相關試劑盒測定葉酸、維生素B12。血漿Hcy 濃度小于10 μmol/L時為正常值，10 μmol/L以上為高Hcy 血癥。

1.3.2 MTHFR 基因分型檢測 (1) 首先需提取DNA，取所有受試者靜脈血2 mL，經EDTA抗凝處理，根據DNA 提取試劑操作說明方法完成提取和純化，樣本DNA 置于-20℃保存，凍融小于3 次； (2) 其次對純化后的DNA 標本進行PCR 擴增，適用0.2 mL 的擴增反應管分裝MTHFR擴增液，擴增反應體系共25 μL (19 μL 擴增液、1 μL 反應液、5 μL DNA 模板) ，在94℃中預變10 min，進行95℃變性30 s、57℃退火45 s、72℃延伸45 s循環25次，在72℃延伸5 min時停止；擴增后置于2℃～8℃環境保存； (3) 最后進行雜交、顯色，取出擴增液產物10 μL 與雜交緩沖液進行混合，取抗體1支進行低速離心，對抗體進行稀釋，取出標記好的MTHFR基因芯片進行雜交，采用基因芯片圖像分析軟件進行掃描圖像，分析數據，觀察MTHFR 677 位點的等位基因，分別定義為C/C、C/T、T/T三種分型。

1.4 統計學方法 應用SPSS22.0統計軟件進行數據分析，計量資料符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受檢者的血漿Hcy水平等指標比較 觀察組患者的血漿Hcy水平明顯高于對照組，葉酸、維生素B12水平明顯低于對照組，差異均具有統計學意義 (P＜0.05) ；觀察組患者收縮壓明顯高于對照組，差異有統計學意義 (P＜0.05) ，但舒張壓、總膽固醇、甘油三酯、LDL、HDL組間比較差異均無統計學意義 (P＞0.05) ，見表2。

表2 兩組受檢者的血漿Hcy水平等指標比較

表2 兩組受檢者的血漿Hcy水平等指標比較

注：1 mmHg=0.133 kPa。

組別例數觀察組對照組t值P值300 300 Hcy (μmol/L) 19.89±8.78 12.88±5.93 11.459 9＜0.05葉酸 (ng/mL) 5.62±1.34 7.32±3.53 7.798 4＜0.05維生素B12 (pg/mL) 347.82±125.32 476.43±122.65 12.703 6＜0.05收縮壓 (mmHg) 150.22±25.24 130.43±12.54 12.162 2＜0.05舒張壓 (mmHg) 85.62±13.44 84.43±15.43 1.007 3 0.314 2總膽固醇 (mmol/L) 6.47±2.36 6.72±1.13 1.654 9 0.098 5甘油三酯 (mmol/L) 1.62±0.24 1.59±0.64 0.760 2 0.4474 LDL (mmol/L) 4.42±2.55 4.32±2.63 0.472 8 0.636 5 HDL (mmol/L) 1.32±0.48 1.33±0.43 0.268 8 0.788 2

2.2 兩組受檢者的血漿MTHFR基因分布頻率比較 經Hardy-Weinberg平衡定律檢測觀察組MTHFR等位基因分布的頻率，其中C/C、C/T、T/T 實際頻數分別為90、129、81，預計頻數分別為89、131、80，數據均符合平衡定律 (χ2=3.347 8，P=0.067 5) ，表示均來自孟德爾群體。觀察組C/C基因型頻率及C等位基因頻率明顯低于對照組，T/T 基因型頻率及T 等位基因頻率明顯高于對照組，差異均具有統計學意義 (P＜0.05) ；觀察組患者的C/T 基因型頻率略高于對照組，但差異無統計學意義 (P＞0.05) ，見表3。

表3 兩組受檢者的血漿MTHFR基因分布頻率比較[例 (%) ]

2.3 兩組受檢者的不同基因分型血漿Hcy水平比較 兩組受檢者的T/T基因型血漿Hcy水平明顯高于C/C、C/T 基因型，差異均具有統計學意義 (P＜0.05) ；觀察組患者的C/C、C/T、T/T基因型血漿Hcy水平明顯高于對照組，差異均具有統計學意義 (P＜0.05) ，見表4。

表4 兩組受檢者的不同基因分型血漿Hcy水平比較，μmol/L)

表4 兩組受檢者的不同基因分型血漿Hcy水平比較，μmol/L)

注：與T/T基因型比較，aP＜0.05。

組別觀察組對照組t值P值例數300 300 C/C 14.89±4.78a 12.88±4.93a 5.069 9＜0.05 C/T 16.62±4.34a 13.32±3.53a 10.217 1＜0.05 T/T 26.82±7.32 24.43±5.65 4.476 8＜0.05

3 討論

腦卒中即腦血管疾病患者因遺傳因素、環境因素等多種因素誘發，導致患者腦血管出現供血不足、閉塞或破裂現象，腦功能嚴重損傷，且腦卒中病情發展迅速，發病率高且發病后具有較高的致死率[7]。因此，近些年有關腦卒中的預防和評估一直是臨床治療腦卒中研究的熱點。根據有關資料顯示，高HCY血癥是形成血栓的獨立危險因素，可能機制是HCY升高能夠造成內皮細胞損傷，平滑肌細胞質增殖，血小板活性增強，通過氧化應激反應，凝血激酶升高，抗凝血蛋白下降，從而促進腦卒中病情的產生和發展[8-9]。

本研究結果顯示，腦卒中患者與正常健康受試者的血壓狀況及總膽固醇、甘油三酯、LDL、HDL 差異無統計學意義，而腦卒中患者的血漿Hcy 明顯較高，而葉酸、維生素B12水平明顯較低。研究結果證實了上述理論，這提示當機體Hcy 水平升高時會導致生成氧自由基，血管內皮細胞受損，從而使一氧化氮和前列環素合成降低，低密度脂蛋白氧化，血小板功能障礙，形成泡沫細胞，抑制腦血管動脈彈性，從而使血管阻力加大，增加腦血管血栓的風險。同時，葉酸、維生素B12水平作為輔酶一旦缺乏也會導致Hcy水平升高，極易引起血管栓塞性事件的發生，這可能在于血漿Hcy 作為一種中間產物氨基酸，作用于人體甲硫氨酸循環中，主要通過再甲基化和轉硫兩種途徑完成代謝過程，完成代謝過程需要MTHFR、葉酸、輔酶維生素B12共同作用。

此外，本研究發現MTHFR 基因多態性分布頻率，結果顯示腦卒中患者相較于正常健康者具有更高的T/T基因型頻率及T等位基因頻率，而C/C基因型頻率及C等位基因頻率顯著較低。這提示血漿Hcy代謝過程以5-甲基四氫葉酸作為甲基供體，能夠經MTR 作用重新合成甲硫氨酸，其中葉酸是轉化5-甲基四氫葉酸的關鍵成分，MTHFR 能夠催化形成5、10-亞甲基四氫葉酸還原成N5-甲基四氫葉酸，因此MTHFR基因是Hcy 代謝中的關鍵酶。MTHFR 基因常見的酶缺陷是指MTHFR基因序列677 位點的點突變，發生由C 到T 的變化，導致丙氨酸變為纈氨酸，使MTHFR 酶活性降低約65%，與葉酸結合能力下降，增加血栓形成風險[13-14]。一旦MTHFR出現含量不足或活性降低，引發Hcy代謝不足，體內聚集，Hcy升高，引起高Hcy血癥，從而導致腦卒中風險升高[15]。

根據臨床研究資料，C/C基因型的MTHFR酶的活性最高，C/T 基因型的活性中等，活性約為正常的65%，T/T基因型活性最低，活性約為正常的30%[18-19]。本研究結果證實了上述理論，根據不同基因分型Hcy 水平結果顯示，T/T 基因型血漿Hcy 水平明顯高于C/C、C/T 基因型，同時腦卒中患者的三種分型的血漿Hcy 水平均高于正常健康者，這提示腦卒中MTHFR基因的活性下降，導致Hcy再甲基化作用過程中出現代謝障礙，Hcy 水平升高，從而增加腦卒中的風險[20]。

綜上所述，血漿MTHFR基因多態性、Hcy 水平與腦卒中的發生具有一定的關系，臨床上檢測兩種指標可以有助于及時提供針對性的預防和個體化治療方案。