高效液相色譜法同時測定桑姜感冒片中3種成分的含量

姚 璐，于 蕾，潘若婕，郝乘儀

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

桑姜感冒片是由桑葉、連翹、菊花、苦杏仁、紫蘇葉、干姜這6種中藥所制得，配方源于中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論組方，以桑菊飲的配方為基礎(chǔ)方，在此加減而成，具有散風(fēng)清熱、祛寒止咳的功效，為2015版《中國藥典》所收錄的品種[1]。

方中桑葉具有疏散風(fēng)熱、清肝明目的作用，可清肝熱肺熱，能夠治療因肺熱引起的發(fā)熱、咳嗽、咽癢等癥狀，還可涼血止血;菊花能夠疏散風(fēng)熱和清熱解毒;連翹有清熱解毒、排膿消腫的功效，可治火郁;苦杏仁能夠止咳平喘、降氣、潤腸通便;紫蘇葉有發(fā)散風(fēng)寒、具有理氣寬中的作用;干姜辛熱，具有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲的功效[2-4]。六味中藥共同作用，溫清并用，桑葉、連翹、菊花的涼寒借苦杏仁、紫蘇葉、干姜之溫，避免了傷陽，而苦杏仁、紫蘇葉、干姜的辛熱借桑葉、連翹、菊花之涼避免了傷津從而達到很好的治療效果[5-6]。方中的桑葉和菊花中含有的綠原酸具有抑制脂肪酸合成、降血糖、抗氧化、殺菌增強免疫力等作用;菊花中的黃芩苷具有抗炎、解熱、降壓、鎮(zhèn)靜、抗變態(tài)等作用;連翹中的連翹苷具有抗氧化、解熱、抗炎、抗菌、抗病毒、降血脂等作用[7-8]。

在2015版《中國藥典》中僅有測量桑姜感冒片中連翹苷含量的方法。為避免不良生產(chǎn)廠家僅以連翹苷的含量作為生產(chǎn)標準、而減少其他有效成分的含量從而降低了治療效果，本實驗建立了測定桑姜感冒片中3種成分的含量的方法，同時測定桑姜感冒片中綠原酸、黃芩苷、連翹苷的含量，提高檢測效率，從而使對該藥品的質(zhì)量控制更加全面，對桑姜感冒片制劑檢測提供了一定的補充。

1 實驗材料

1.1 實驗藥品

桑姜感冒片(四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限公司)，綠原酸標準品(批號110753—201817，中國食品藥品鑒定研究院)，黃芩苷標準品(批號110715—201821，中國食品藥品鑒定研究院)，連翹苷標準品(批號110821—201816，中國食品藥品鑒定研究院)，甲醇(色譜純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司)，乙腈(色譜純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司)，磷酸(色譜純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實驗儀器

PLATSILTMODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，日本島津LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-20A紫外檢測器，島津LC-solution工作站，CBM20A系統(tǒng)控制器，SIL-20A自動進樣器，CTO-20A型柱溫箱，LC-20AT二元泵，DGU-20A脫氣機，SPD-M20A二極管陣列檢測器，ESJ200-4B型電子天平(賽多利斯)，KQ-500GVDV型三頻恒溫數(shù)控超聲波清洗器(功率250 W,昆山市超聲儀器有限公司)，電熱恒溫干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)，微孔濾膜(0.45 μm)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，采用梯度洗脫(1～18 min,10%-20%A;18～42 min,20%-70%A)，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為278 nm，進樣量20 μL。在此色譜條件下,綠原酸、黃芩苷、連翹苷的分離度均大于1.5，塔板理論數(shù)均大于3000。陰性對照在其對應(yīng)的保留時間內(nèi)也未出峰,混合對照品溶液及樣品溶液色譜圖見圖1。

1.綠原酸；2.黃芩苷；3.連翹

2.2 混合對照品溶液的制備

根據(jù)樣品中綠原酸、黃芩苷、連翹苷峰面積與單一標準品峰面積對比，配置混合標準品溶液。

取0.198 g/L的綠原酸標準品溶液2 mL、0.136 g/L的黃芩苷標準品溶液4 mL、0.98 mg連翹苷標準品放入10 mL容量瓶中，用甲醇定容，再進行超聲處理1 min，即得混合標準品溶液。在“2.1”色譜條件下，進樣20 μL。

2.3 供試品溶液的制備

取桑姜感冒片，去糖衣，研細至粉末，精密稱取0.998 45 g，置于250 mL磨口錐形瓶中，加入20 mL的甲醇，搖晃震蕩后，超聲波處理60 min，冷卻后經(jīng)微孔濾膜過濾即得。在“2.1”色譜條件下，進樣20 μL。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1線性考察

取混合標準品溶液，向高效液相色譜儀中分別進樣1、5、10、20、25 μL，以混合標準品溶液進樣量(x)為橫坐標,其峰面積(y)為縱坐標,進行線性回歸，得到標準曲線?；貧w方程分別如下:

綠原酸y=74 124x+66 077，R2=0.992 1

黃芩苷y=164 723x-34.647，R2=0.999 6

連翹苷y=93 937x+5 160.8，R2=0.999 5

2.4.2精密度實驗

取混合標準品溶液，在“2.1”的色譜條件下，連續(xù)6次精密進樣20 μL，由此得到該6次的綠原酸、黃芩苷、連翹苷的峰面積，經(jīng)計算可得出綠原酸、黃芩苷、連翹苷的精密度RSD(n=6)分別為1.3%、1.4%、0.7%?？梢源_定所使用的儀器具有良好的精密性。

2.4.3穩(wěn)定性實驗

將制得的供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h時進行進樣測定，得到不同時間進樣的綠原酸、黃芩苷、連翹苷的峰面積，進行計算可得出綠原酸、黃芩苷、連翹苷的穩(wěn)定性RSD(n=6)分別為1.2%、1.6%、0.6%。說明24 h內(nèi)，該桑姜感冒片樣品溶液穩(wěn)定性較好。

2.4.4線性考察

重復(fù)性實驗取桑姜感冒片，精密稱取，按“2.3”項下的方法制得6個供試品溶液，在“2.1”色譜條件下分別進樣20 μL，由此得到該6次的綠原酸、黃芩苷、連翹苷的峰面積，經(jīng)計算可得出綠原酸、黃芩苷、連翹苷的重復(fù)性RSD(n=6)分別為1.6%、0.6%、0.9%。說明該試驗方法有較好的重復(fù)性。

2.4.5加樣回收率實驗

取足量的桑姜感冒片，除去外包糖衣，研細至粉末，用電子天平精密稱取6份，為0.528 5、0.502 1、0.514 0、0.508 7、0.497 5、0.483 3 g，分別加入相當于樣品中綠原酸、黃芩苷、連翹苷含有量100%的適量的標準品溶液6份，按“2.3”項下的方法制得6個供試品溶液，進樣20 μL，得到色譜圖。分別計算得出綠原酸、黃芩苷、連翹苷的加樣回收率以及其RSD值,分別為102.11%(RSD 1.51%)、95.99%(RSD 1.87%)、99.82%(RSD 1.64%)。

3 討 論

在2015版藥典中僅有測量桑姜感冒片中連翹苷含量的方法。為了更好更全面地對桑姜感冒片進行質(zhì)量把控，本實驗建立了同時測定桑姜感冒片中3種成分的含量，使對該藥品的質(zhì)量控制更加全面。

所測的綠原酸、黃芩苷、連翹苷均可溶于甲醇，故選用甲醇進行超聲提取。

流動相在乙腈-磷酸和甲醇-磷酸等實驗選擇做對比，發(fā)現(xiàn)使用乙腈-0.1%磷酸作為流動相時，綠原酸、黃芩苷、連翹苷的分離效果好，基線平穩(wěn)，峰形良好，且理論塔板數(shù)和分離度都較好。

切換波長，綠原酸在327 nm處有最大吸收波長，黃芩苷在278 nm處有最大吸收波長，綠原酸在230 nm處有最大吸收波長。在278 nm下綠原酸、黃芩苷、連翹苷的峰形都較好、分離度高、理論塔板數(shù)好。可以在同一波長下觀察測定更為方便簡潔。

采用梯度洗脫，第一梯度洗脫較慢，為了讓綠原酸完整出峰，峰形良好。第二梯度洗脫較快，因為所需測得的黃芩苷、連翹苷所需洗脫濃度較高，加快洗脫壓縮時間，保證峰形良好的狀態(tài)下，選擇較快時間洗脫，該方法在實際應(yīng)用上更為方便。