血清miR-3614-5p 在妊娠期肝內膽汁淤積癥診斷中的價值

趙軍，孟西娜，侍佳，董蕊銳，李娜，王瑤，鄒萍，張婷，許耀輝

妊娠期肝內膽汁淤積癥（ICP）是一種妊娠期特有的以皮膚瘙癢和黃疸為主要臨床癥狀的疾病，其在中國的發生率約為4%～10%［1］。ICP 會引起較高的早產率以及胎兒窘迫、新生兒死亡等情況［2-3］。目前為止，ICP 的發病原因尚不十分清楚。總膽汁酸（TBA）是現階段診斷ICP 的主要指標，但其仍有不足［4］。尋找一個能夠及時準確診斷ICP的靶標是當前ICP治療與監測的方向。

微小RNA（microRNA，miRNA）是長度為18～23 nt的非編碼RNA序列，可參與多種生物學過程。血清miRNA 已被報道為妊娠并發癥的診斷和預后生物標志物，如妊娠糖尿病和先兆子癇［5-6］。本課題組前期分析了ICP 的血清miRNA 譜并驗證了部分差異表達miRNA［7］。本研究擬通過檢測ICP病人血清miR-3614-5p的表達并與臨床和生化參數進行相關分析，來探討血清miR-3614-5p作為診斷ICP的候選生物標志物的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采集2017 年11 月至2018 年10 月于南京醫科大學附屬無錫婦幼保健院婦產科就診的ICP 孕婦79 例，均符合中華醫學會制訂的ICP 診療指南的標準（2015版）［8］。同時按隨機數字表法選取就診的健康孕婦79 例。要求各型肝炎病毒標志物均為陰性，無心、肝、腎功能異常，無臨床急性或慢性疾病癥狀，未接受任何藥物治療。收集新鮮血液標本，且標本收集前均未做過任何治療。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》的相關要求。

1.2 主要試劑與設備 RNA提取試劑盒（北京百泰克）；Prime Script TM RTⅡ逆轉錄試劑盒（TaKaRa，大連寶生物）；SYBR Premix Ex TaqⅡ擴增試劑盒（TaKaRa，大連寶生物）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司）；ABI 7500 Fast 熒光定量PCR 儀器（ABI，美國）；UV-1900紫外分光光度計（日本島津）；Gel Doc XR+凝膠成像儀（Bio-Rad，美國）；XH600電泳儀（上海昕慧）。

1.3 RNA 提取及miRNA 表達檢測 血清miR-3614-5p檢測采用實時熒光定量PCR（qPCR）法。分別留存兩組病人靜脈血樣本5 mL，1 000 r/min 離心10 min，將上層血清轉移至無酶管再以10 000 r/min離心10 min 吸取上層血清于無酶管－80 ℃凍存備用，按照試劑說明書，提取總RNA逆轉錄生成cDNA。以miR-16作為內參，采用相對定量2-ΔΔCT法計算兩組標本miR-3614-5p水平［8］，以ΔCT值表示其相對表達量水平，ΔCT值越低，其相對表達量越高。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：miR-16 正向：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACcgccaa-3′，反 向：5′ -GCTTGTAGCAGCACGTAAATATTG-3′；miR-3614-5p 正向：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACctgaag -3′，反 向：5′TACTAAATCGGGCAGCCTTCAG-3′。采用SYBR Premix ExTaqII 試劑盒檢測每個擴增循環后SYBR Green熒光信號水平，總反應體系20 μL，反應條件：95 ℃、10 min 預變性；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40 個循環。實驗重復3次。

1.4 統計學方法 使用SPSS 22.0統計軟件對數據進行處理分析。數據不滿足正態分布，以M（P25，P75）表示，組間差異分析采用Mann-WhineyU非參數檢驗法。對ICP組與對照組結果繪制受試者工作曲線（ROC），ROC曲線下面積（AUC）的比較采用Hanley-McNeil 非參數檢驗法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ICP 組與對照組生化指標以及臨床參數的比較 ICP 組在年齡，孕周上與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），在生化指標TBA、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平上均差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組孕婦生化指標以及臨床參數的比較/M（P25，P75）

2.2 ICP 病人血清miR-3614-5p 的表達水平及與TBA 相關性 qPCR 檢測結果顯示，79 例ICP 病人血清miR-3614-5p的相對表達量［ΔCT：9.893（8.635，10.166）］較對照組［ΔCT：10.841（10.256，11.987）］增加，差異有統計學意義（Z＝6.00，P＝0.001）。且血清miR-3614-5p表達水平與TBA呈正相關（r＝0.311，P＜0.001），見圖1。

圖1 妊娠期肝內膽汁淤積癥（ICP）病人中miR-3614-5p與總膽汁酸（TBA）的相關性

2.3 ICP 病人血清miR-3614-5p ROC 曲線分析血清miRNA-1182 在ICP 組中AUC、靈敏度、特異度分別為0.864、79.0%和83.0%，見圖2。

3 討論

圖2 妊娠期肝內膽汁淤積癥（ICP）病人血清miR-3614-5p受試者工作特征曲線（ROC）

ICP 是一種特發于妊娠中晚期，以出現瘙癢及黃疸為主要臨床癥狀的疾病，它對母體的影響主要表現在頑固性瘙癢和易于產后出血而導致產婦死亡率增加，對胎兒的影響更甚，可導致早產、胎糞污染、新生兒窒息、新生兒死亡、新生兒神經系統后遺癥等［9］。目前，ICP 的發病原因及發病機制尚不明確，大量的流行病學研究以及臨床觀察實驗室研究認為可能與遺傳、激素、基因突變、營養和環境因素有關。ICP 的診斷也沒有統一標準，中華醫學會制訂的ICP 診療指南（2015 版）指出TBA 是目前診斷和檢測ICP 的主要指標，但皇家婦產科醫師學會（RCOG）指南并不十分認同［8］。ICP 既難以預料又無法準確監測，帶給廣大產科工作者巨大困惑的同時，也給孕產婦及家屬帶來極大的精神創傷，因此極易引起醫療糾紛。選取更靈敏和特異的指標對ICP 病人盡早進行診斷以及改善預后具有顯著的意義。

microRNAs 是一類內源性的短序列非編碼小分子，大量研究表明其在細胞分化、增殖和生長，細胞凋亡，血管生成，炎癥等生理和病理過程中起著重要作用［10］。血清miRNA 表達穩定并易于檢測，是一種非常有前景的診斷標志物［11］。自2008 年Chim 研究組首次提出循環miRNA 可作為妊娠相關并發癥的生物標志物起，大量的miRNAs 被鑒定并成為妊娠疾病的生物標志物［5-6］。本研究在前期ICP 血清miRNA 譜的基礎上，挑選miR-3614-5p 進行臨床驗證，發現其在ICP 病人中較對照組高表達，且差異有統計學意義，在ICP 孕婦組ROC 曲線下AUC、靈敏度、特異度分別為0.864、79%和83%，提示miR-3614-5p 是診斷和評估ICP 病人的理想標志物之一。

眾所周知，血清TBA是膽固醇被肝臟分解后進入肝腸循環出現的物質，其代謝情況與肝臟功能障礙、實質損傷關系密切。孕中晚期雌激素波動幅度大，膽鹽代謝障礙，影響肝細胞功能，進而血清TBA異常升高、肝功能指標異常，這也是血清TBA 用于檢測ICP 的原理［12］。但miR-3614-5p 與ICP 的相關研究還是空白。但在生物信息學分析中，我們發現miR-3614-5p 主要調控的功能有脂質磷酸化、細胞黏附、細胞凋亡、蛋白激酶結合等，可能參與MAPK信號通路，代謝途徑，Wnt 信號通路等生物過程［7］。尤其是MAPK 信號通路與脂類代謝密切相關，而脂類代謝是已明確的ICP發病機制之一。據此我們推測miR-3614-5p 在ICP 發病過程中也發揮了一定的功能作用，這還需要進一步的實驗研究。

綜上所述，本研究驗證了ICP 病人血清中高表達的miR-3614-5p，可作為檢測ICP 的一種新型靶標，具有一定的臨床應用價值。