合并肺間質病變或惡性腫瘤皮肌炎患者的外周血差異基因表達分析

薛珂 權晟 趙茜 刁立誠 陳夢雅 朱雪梅 鄭捷 曹華 黎皓上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院皮膚科 0005；上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院呼吸與危重癥醫學科 0005；上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院腫瘤科 0005

目前把以皮肌炎（dermatomyositis，DM）典型皮損為主要表現、至少6個月沒有肌炎表現或者實驗室檢查存在輕度異常的患者統稱為臨床無肌病性皮肌炎（clinical amyopathic dermatomyositis，CADM）或皮肌炎樣皮病［1］。DM/CADM病因不明，臨床表現呈多樣性和異質性。CADM患者往往在疾病早期僅有皮肌炎的皮膚表現，而數周或數月后突然出現急進型肺間質病變（interstitial lung disease，ILD），同時伴有發熱、氣促，很快進展為呼吸衰竭，影像學表現為兩肺彌漫性滲出伴毛玻璃影等間質性改變，從出現皮疹到死亡平均2～6個月［2］。13%～42%的DM/CADM病例伴有腫瘤，大多為實體瘤，可能在DM/CADM確診1年或數年后出現，此時由于已使用大劑量糖皮質激素等免疫抑制劑和嚴重的皮膚損害、肌肉癥狀，可能延誤手術時機［3-4］。因此早期診斷和治療DM/CADM及其合并癥可以改善預后，提高生存率。高通量RNA測序（RNA-Seq）技術可以在沒有某一物種完整基因組序列的情況下，準確獲取特定組織在某一狀態下轉錄組基因的全部信息，完整記錄該條件下基因表達水平、生物學過程的分子機制以及遺傳標記信息等［5］。目前國內外已有報道將RNA-seq技術用于銀屑病、系統性紅斑狼瘡、嬰兒血管瘤以及硬皮病等疾病的研究［6-9］。我們通過RNA-seq技術對合并ILD或惡性腫瘤的DM/CADM進行高通量轉錄組測序，研究其可能的發病機制，同時為治療提供潛在靶點。

對象與方法

一、對象

2017年1月至2018年1月于上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院皮膚科確診的DM/CADM患者27例，所有患者納入研究前均未接受治療或1個月內僅接受小劑量糖皮質激素（潑尼松劑量不超過10 mg/d）治療。其中女19例，男8例，年齡20～79（51.00±13.80）歲。按照合并癥狀分為3組，即合并ILD組10例，合并惡性腫瘤組8例，無ILD和惡性腫瘤組9例。上述患者的診斷均滿足Bohan-Peter的DM分類標準［10］或Sontheimer的CADM診斷標準［11］。ILD診斷標準：①肺功能異常，具體表現為限制性通氣功能障礙，彌散功能降低，CO彌散率（DLCO）＜80%時具有診斷意義；②不明原因的靜息或活動后氣促；③不明原因干咳＞3個月；④肺部聽診聞及Velcro啰音；⑤肺高分辨率CT有ILD的影像學改變。符合上述ILD診斷標準中1項及以上且發病時病原學檢查排除肺部感染時診斷為ILD。同時收集7例門診體檢患者作為健康對照，均無系統性疾病和自身免疫性疾病及其家族史，其中女4例，男3例，年齡25～70（54.00± 18.65）歲，與患者組性別、年齡差異均無統計學意義（P值分別為0.656、0.373）。本研究通過上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院醫學倫理委員會批準（2016臨倫審第105號），所有受試者均簽署知情同意書。

二、方法

1.樣本收集：采集DM/CADM患者和健康對照者外周血2.5 ml于Paxgene RNA全血管（美國BD公司）中，保存于-80℃冰箱中直至送樣測序。

2.RNA-seq測序：保存于Paxgene RNA全血管中的全血經檢測合格后，利用Oligo（dT）磁珠和磁分離器分離并純化mRNA。將mRNA打斷為片段，通過PCR擴增富集得到DM/CADM患者外周血轉錄組cDNA文庫，最后對構建好的文庫進行高通量測序。測序由武漢華大醫學檢驗所有限公司協助完成，通過BGI-SEQ-500平臺共檢測34個樣本。對測序獲得的原始數據進行過濾（即質量控制），去除原始數列中低質量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的短序列（reads）。采用濾過后序列中質量值大于20或30的堿基數占總堿基的比例（Q20/Q30）來表示數據質量，Q20和Q30越大，數據質量越高，采用HISAT軟件將這些數據比對到參考基因序列，獲得比對率，比對率越高，則數據結果越可靠。

3.差異基因表達及GO與KEGG通路分析：對過濾后所得數據進行差異表達基因（differential expressed genes）篩選，篩選標準：①差異表達倍數＞2或＜1/2，即|log2（差異倍數）|＞1；②錯誤發現率（false discovery rate）＜0.05。進一步對差異基因進行基因本體論（gene ontology，GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。GO按功能分別為分子功能、細胞組分和生物過程。

三、統計學方法

全部實驗數據用GraphPad Prism 6.01統計軟件處理。數據符合正態分布時，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗；數據不符合正態分布時，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、RNA-seq數據質量分析

通過測序，每個樣本平均產出21.71 Mb數據，比對基因集的平均比對率為79.83%，共檢測到18 072條基因。數據過濾后，平均每個樣本Q20達到98.56%，Q30達到91.94%。樣品比對基因組的平均比對率達94.42%。

二、DM/CADM患者差異表達基因及其功能注釋

圖1 皮肌炎/臨床無肌病性皮肌炎（DM/CADM）患者差異基因火山圖 1A：DM/CADM組與健康對照組比較，4 820條基因表達上調，137條基因表達下調；1B：合并肺間質病變組與無肺間質病變和惡性腫瘤組比較，272條基因表達上調，158條基因表達下調；1C：合并惡性腫瘤組與無肺間質病變和惡性腫瘤組比較，398條基因表達上調和68條基因表達下調

DM/CADM患者與健康對照相比，差異表達的基因共4 957個，其中4 820條基因表達上調，137條基因表達下調（圖1A）。上調倍數最高的前10位基因分別為MTPN、SLC6A3、EIF3CL、HSPE1-MOB4、G0S2、C-X-C 趨化因子配體 2（CXCL2）、TBC1D3K、C-C趨化因子配體8（CCL8）、RGPD6、AREG；下調倍數最高的前10位基因分別為GAGE12B、GAGE4、STC2、GAGE2D、MAGEA6、MAGEC2、GAGE5、CSMD2、GAGE7、NPPB。通過差異表達基因的GO功能分析得到分類條目49個，其中8個（16.3%）與細胞組分相關，4個（8.2%）與分子功能相關，37個（75.5%）與生物過程相關（圖2A）。

KEGG信號通路分析顯示，與健康對照相比，DM/CADM患者具有43條顯著差異性富集通路（P＜0.05），其中前10位的通路分別為細胞周期、無翅基因（Wnt）信號通路、基底細胞癌、西羅莫司靶蛋白（mTOR）信號通路、黑素合成、RNA降解、線粒體自噬、成人T淋巴細胞白血病病毒Ⅰ型感染、腫瘤中的蛋白聚糖以及轉錄因子（圖3A）。

三、合并ILD的DM/CADM患者差異表達基因及其功能注釋

合并ILD組與無ILD和惡性腫瘤組相比，差異表達的基因共430個，其中272條基因表達上調，158條基因表達下調（圖1B）。上調倍數最高的前10位基因分別為EIF3CL、CCL20、IL1A、SLC6A3、FOXD4L3、LIMS3、PTGES3L-AARSD1、ALX4、TBC1D3H、CLEC14A；下調倍數最高的前10位基因分別為 TBC1D3K、COL26A1、NPIPA7、TBC1D3F、TRIM49D2、FAM187B、POTEE、CYP26B1、TRIM64、TRIM64B。這些差異表達基因主要編碼Ⅰ型干擾素誘導趨化因子（MCP-1）和表皮生長因子，參與轉錄和自噬。通過差異表達基因的GO功能分析得到顯著富集條目157個，其中27個（17.2%）與細胞組分相關，16個（10.2%）與分子功能相關，114個（72.6%）與生物過程相關（圖2B）。

KEGG信號通路分析顯示，與未合并ILD和惡性腫瘤組相比，合并ILD組具有41條顯著差異性富集通路（P＜0.05），前10位分別為瘧疾、沙門菌感染、白細胞介素17（IL-17）信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、細胞因子及其受體相互作用、趨化因子信號通路、類風濕關節炎、Toll樣受體信號通路、軍團桿菌感染和百日咳（圖3B）。

四、合并惡性腫瘤的DM/CADM患者差異表達基因及其功能注釋

合并惡性腫瘤組與無ILD和惡性腫瘤組相比，差異表達的基因共466個，其中398條基因表達上調，68條基因表達下調（圖1C）。上調倍數最高的前10位基因分別為 EIF3CL、TBC1D3H、C2CD4B、AREG、RASD2、H2AFB3、KIR2DL5B、CH25H、PALMD、GTF2H2C；下調倍數最高的前10位基因分別為TBC1D3K、CYP26B1、RIMBP3C、TRIM6-TRIM34、PCDHGA3、SYT5、WIF1、POTEE、FAM187B、SPDYE2B。通過差異表達基因的GO功能分析得到顯著富集條目117個，其中11個（9.4%）與細胞組分相關，12個（10.3%）與分子功能相關，94個（80.3%）與生物過程相關（圖2C）。

圖2 皮肌炎/臨床無肌病性皮肌炎（DM/CADM）患者差異基因基因本體論（GO）功能注釋 2A：DM/CADM患者組與健康對照組比較；2B：合并肺間質病變的DM/CADM患者組與無肺間質病變和惡性腫瘤的DM/CADM患者組比較；2C：合并惡性腫瘤組與無肺間質病變和惡性腫瘤組比較

圖3 皮肌炎/臨床無肌病性皮肌炎（DM/CADM）患者差異基因京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 3A:DM/CADM患者組與健康對照組比較；3B：合并肺間質病變組與無肺間質病變和惡性腫瘤組比較；3C：合并惡性腫瘤組與無肺間質病變和惡性腫瘤組比較

KEGG信號通路分析顯示，與無ILD和惡性腫瘤組相比，合并惡性腫瘤組具有顯著差異性的富集通路32條（P＜0.05），前10位分別為糖基化、趨化因子通路、抗原提呈、類風濕關節炎、自然殺傷細胞介導的細胞毒作用、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、沙門菌感染、細胞因子及其受體互相作用、蛋白質的消化與吸收（圖3C）。

討 論

DM/CADM是多種因素誘發的特發性炎癥性肌病，通常認為感染、藥物、遺傳等因素參與其發病［12］，但具體發病機制尚不清楚。目前研究表明［13］，在系統性紅斑狼瘡、銀屑病、類風濕關節炎等多種自身免疫病以及炎癥性疾病中mRNA異常表達。我們通過RNA-Seq技術研究DM/CADM患者差異表達基因及其所富集的通路，發現DM/CADM患者與健康對照相比差異表達基因中上調基因占絕大部分，提示多種基因的高表達可能參與疾病的發生。這些差異表達的基因主要編碼MCP-1和表皮生長因子，參與轉錄和自噬。Bilgic等［14］也曾報道，MCP-1在合并ILD的DM/CADM中顯著高表達。已知線粒體自噬與免疫系統密切相關［15］，參與病原體的識別和降解、抗原提呈及T細胞的發育、分化等多個環節，參與多發性硬化、系統性紅斑狼瘡、系統性硬化等自身免疫病的發病過程。自噬相關分子西羅莫司靶蛋白（mTOR）、微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ型、低氧誘導因子1α等參與皮肌炎發病的具體機制尚不明確［16］。我們發現，在DM/CADM患者中mTOR激活分子LAMTOR1和HIF1A mRNA顯著高表達，提示自噬可能參與DM/CADM的發病機制。DM/CADM患者中顯著上調的通路主要涉及腫瘤、感染和免疫反應等，其中腫瘤相關通路占50%。

DM/CADM患者臨床表現呈多樣性、異質性，部分患者合并ILD或者惡性腫瘤。我們分析了不同臨床表型DM/CADM患者的外周血差異基因及其所富集的通路。合并ILD的DM/CADM患者中，細菌感染、細胞因子/趨化因子等通路顯著富集，并未見腫瘤相關通路。由于難以進行肺組織活檢，ILD的致病原尚未明確。病毒感染是誘發或加重皮肌炎的重要因素［17-18］，但至今未找到病毒感染的確切依據。多項研究顯示，細菌感染在紅斑狼瘡和銀屑病的發病中起重要作用［19-20］。DM患者的皮膚和肌肉組織中抗菌肽LL-37表達增加［21］，結合我們RNA-Seq結果中細菌感染富集通路顯著高表達，推測細菌很可能也是DM/CADM合并ILD的致病原，其機制需要進一步研究。目前認為Ⅰ型干擾素通路的活化是DM/CADM發病機制的重要環節，多項研究已發現合并急進型/亞急性ILD的DM/CADM患者血清存在相關抗體，易發生潰瘍性Gottron丘疹/征，死亡率高，預后差［22］。多項研究表明，血清IL-6、IL-18、干擾素β、CCL-2、CXCL-9和CXCL10等細胞因子和趨化因子水平與DM/CADM合并ILD嚴重程度相關［23-26］。本研究從轉錄水平證實并發ILD的DM/CADM患者細菌感染和細胞因子/趨化因子通路顯著富集。

目前研究表明，腫瘤的發生與交叉免疫反應、免疫功能紊亂、病毒感染以及遺傳因素有關［27］。我們從基因轉錄水平發現，DM/CADM患者病毒感染、免疫相關通路顯著富集。此外，Wnt信號通路及腫瘤代謝通路占顯著富集通路的大部分（50%），提示DM/CADM患者可能在基因轉錄水平即有腫瘤發生的傾向。在合并惡性腫瘤的DM/CADM患者中差異基因顯著富集于腫瘤相關糖基化、蛋白代謝以及自身免疫過程中的抗原提呈和細胞毒作用等通路，而非細菌感染通路。糖基化終產物結合受體即雙向調節蛋白（amphiregulin）通路對腫瘤的發生十分重要，是腫瘤微環境關鍵調節因子，與腫瘤惡性生長、產生耐藥性以及遠處轉移等相關，扮演著促癌角色［28］。DM/CADM患者腫瘤微環境的改變可能是腫瘤發生的直接原因，而抗原提呈和自然殺傷細胞的細胞毒作用均在抗腫瘤過程中發揮重要作用［29-30］。

DM/CADM患者易合并ILD特別是急進型ILD或惡性腫瘤，預后差，死亡率高。對DM/CADM患者早期診斷和干預治療，有助于降低死亡率，提高生存率。腫瘤、感染、免疫反應等通路基因轉錄水平的改變可能參與DM/CADM的發病。細菌感染、細胞因子/趨化因子通路在合并ILD的DM/CADM患者中顯著富集；而糖基化、蛋白代謝以及抗原提呈和自然殺傷細胞的細胞毒作用在合并惡性腫瘤的DM/CADM患者中顯著富集。這些不同的富集通路可能為明確DM/CADM的發病機制以及為早期判斷和干預合并癥的發生提供潛在的標志物。然而本文為DM/CADM患者基因組的初步研究，病例數較少，將來還需要進一步擴大樣本量進行研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突