蟬芩顆粒通過下調COX-2抑制TRPV1通道減輕感染后咳嗽大鼠氣道神經源性炎癥

呂俊， 余小萍， 沈若冰

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 201203）

感染后咳嗽（post-infectious cough，PIC）是指呼吸道感染的急性期癥狀消失后，咳嗽遷延不愈，多表現為刺激性干咳或咳少量白色黏液痰，伴咽癢，常于講話、運動、冷空氣刺激時誘發或加重[1]。由感覺神經末梢釋放以P物質（SP）為主的速激肽或神經遞質所介導的炎癥反應稱為神經源性炎癥[2]。神經源性炎癥是感染后咳嗽的重要機制之一，也是咳嗽高敏狀態惡性循環的促動因素[3]。環氧化酶2（COX-2）—前列腺素E2（PGE2）—前列腺素E2受體亞型3（EP3）誘導瞬時受體電位類香草酸受體亞型1（TRPV1）通道活化導致速激肽釋放可能在神經源性炎癥中發揮重要作用[4-5]。蟬芩顆粒是上海市名中醫黃吉賡先生結合多年臨床經驗研制的治咳驗方，臨床用于治療急、慢性咳嗽，療效確切。前期研究顯示蟬芩顆粒可有效改善感染后咳嗽患者的臨床癥狀，減輕氣道神經源性炎癥[6]，可減少氣道神經源性炎癥模型大鼠血清中速激肽含量，減輕大鼠氣道神經源性炎癥[7]。本研究觀察不同劑量蟬芩顆粒對感染后咳嗽大鼠COX-2、TRPV1通道的影響，旨在探討蟬芩顆粒治療感染后咳嗽大鼠氣道神經源性炎癥的作用機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡SPF級雄性SD大鼠48只，體質量（200±50）g，購自上海西普爾—必凱實驗動物有限公司，動物質量合格證號：200130016005160。大鼠分籠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，實驗室常規條件下飼養，自由飲水，進食標準普通飼料。適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 實驗藥物 蟬芩顆粒（蟬衣6 g、僵蠶10 g、柴胡15 g、黃芩15 g、半夏10 g、桔梗9 g、枳殼9 g、射干15 g、杏仁10 g、紫菀15 g、前胡10 g、白前15 g），由曙光醫院藥劑室制備，批號：滬藥制字Z06100006。阿斯美，第一三共制藥（上海）有限公司生產，批準文號：國藥準字H20033669。

1.3 主要試劑與儀器 內毒素（LPS），購自美國Sigma公司；辣椒素（CAP），購自MCE（中國）皓元生物有限公司；SP酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒，購自上海威奧生物有限公司；TRPV1抗體，購自美國Proteintech公司。PowerPacTM通用電泳儀、Mini-PROTEANR Tetra電泳槽、小型Trans-Blot?轉印槽（美國Bio-Rad公司）； PCR儀（Roche480II Real Time PCR System，瑞士羅氏公司）；NIKON ECLIPSE TI-SR倒置熒光顯微鏡、NIKON DS-U3成像系統（日本尼康公司）；DENLEY DRAGON Wellscan MK3酶標儀（芬蘭Thermo公司）。

1.4 感染后咳嗽模型制備

1.4.1 動物分組 將48只健康雄性SD大鼠適應性喂養1周后隨機分為6組，即空白組，模型組，蟬芩顆粒低、中、高劑量組，阿斯美組，每組各8只。

1.4.2 造模方法 造模方法參照文獻及課題組前期實驗方案[6，8-11]：將大鼠放入0.5 m3的煙室，用50 g鋸屑+5支香煙點燃煙熏，每次30 min，每日1次，連續10 d，期間自由進食、飲水。第11、14、17天異氟烷淺麻醉大鼠后，鼻腔滴入LPS溶液，濃度為0.4 mg/mL，滴入量按體質量1 μL/g計算。第12、13、15、16、18天，將大鼠放入密閉容器中，用10-4mol/L的辣椒素溶液霧化吸入，每次3 min，每日1次。造模結束后每組各處死1只大鼠驗證造模結果。空白組不參與造模。

1.4.3 感染后咳嗽動物模型成功的判定標準 參照文獻[6，8-11]，大鼠表現出頻繁咳嗽、鼻腔分泌物增多、腹部起伏運動、頸部伸前點頭等特征，而肺實質未見明顯病理改變，即可視為造模成功。

1.5 給藥方法及療程 造模成功后，除空白組外，各組大鼠按10 mL·kg-1的體積進行灌胃給藥，每日1次，連續14 d。根據“人和動物按體表面積折算的等效劑量比值表”折算，給藥劑量：蟬芩顆粒低劑組4.42 g/kg，蟬芩顆粒中劑組9.36 g/kg，蟬芩顆粒高劑組12.78 g/kg，阿斯美組4.78 mg/kg。模型組給予等體積生理鹽水。灌胃期間大鼠自由進食、飲水。灌胃結束后24 h，各組大鼠進行咳嗽敏感性測試后處死、取材。

1.6 實驗過程中動物死亡及實驗方案調整分析 實驗過程中，死亡大鼠總計5只。模型組和蟬芩顆粒低劑量組各1只大鼠于辣椒素霧化時因窒息死亡，蟬芩顆粒高、中劑量組和阿斯美組各1只大鼠灌胃時因誤吸死亡；空白組無大鼠死亡。最終每組選用6只大鼠。

1.7 觀察指標與方法

1.7.1 取材 （1）采血：取大鼠腹主動脈血2 mL至EP管中，分離血清，于4℃，1 500 r/min離心10 min，取上清液，-80℃冰箱中凍存備用，待測血清中SP含量。（2）取肺組織標本：于冰面上取大鼠肺右中葉，裁剪后置于4%多聚甲醛中固定6 h，石蠟包埋切片，待蘇木素—伊紅（HE）染色。取大鼠肺右下葉，放入EP管中，快速放入液氮，-80℃冰箱保存，供后期逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）、蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測用。（3）取大鼠背根神經節：將大鼠俯臥置于冰面，剖開皮膚，鈍性分離，暴露頸胸椎骨，以頸部最隆突（第二胸椎棘突）處定位C7至T5棘突，于正中處分離椎管，暴露脊髓。用顯微外科鑷將脊髓推向一側，暴露并挑起脊神經，在椎間孔處可見背根神經節。用顯微外科剪分離相應神經節，錫紙包裹，快速放入冷凍管，液氮速凍，保存于-80℃冰箱，供后期RT-PCR、Western Blot檢測用。

1.7.2 辣椒素咳嗽激發實驗 藥物灌胃14 d后，進行辣椒素咳嗽激發實驗。辣椒素激發溶液濃度為50 μmol/L，總量為1 mL，觀測10 min（從辣椒素霧化開始計時），記錄大鼠咳嗽次數及咳嗽潛伏期（從辣椒素霧化開始計時到第1次出現咳嗽的時間）。

1.7.3 HE染色 觀察大鼠肺組織病變和炎癥細胞浸潤情況。

1.7.4 ELISA法測血清SP水平 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。應用酶標儀于450 nm波長處測吸光度，繪制標準曲線，求出SP濃度。

1.7.5 RT-PCR法檢測大鼠肺組織和背根神經節COX-2、EP3、TRPV1 mRNA表達水平 于-80℃冰箱中取出各組實驗樣品，分別將肺組織與背根神經節置于勻漿器中充分研磨，利用Trizol試劑盒提取組織RNA進行逆轉錄反應，將制備好的cDNA進行PCR擴增，cDNA引物序列分別見表1。離心混勻后，將反應管置于Real-time PCR檢測儀反應。反應條件：95℃2 min，95℃5 s，60℃10 s，45個循環。作熔解曲線。所有數值先與內參做△Ct，然后用第一個樣品做相對含量=2-△△Ct分析。

表1 COX-2、EP3、TRPV1 PCR引物序列Table 1 PCR prime sequences of COX-2，EP3 and TRPV1

1.7.6 Western Blot檢測大鼠肺組織和背根神經節TRPV1蛋白表達 于-80℃冰箱中取出各組實驗樣品，分別將肺組織與背根神經節置于勻漿器中充分研磨，加入組織裂解液，提取總蛋白，經配膠、蛋白上樣、十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯凝膠電泳（PAGE），轉印蛋白，分別孵育一抗TRPV1抗體（1∶1 000稀釋）、二抗，ECL發光、顯影、定影，應用灰度分析軟件進行光密度計算。用目的蛋白/內參灰度值比值（p）作為目的蛋白的表達量。

1.8 統計方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，計量資料均服從正態分布，以均數±標準差（）進行描述。多組比較采用單因素方差分析及LSD檢驗多重比較。均采用雙側檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物的一般表現及咳嗽情況 造模過程中，可觀察到大鼠逐漸出現不同程度的精神不振、毛色枯黃、咳嗽頻繁、頸部伸前點頭、前肢縮抬抓撓、腹肌抽搐等表現。

模型組大鼠咳嗽次數較空白組明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01）；蟬芩顆粒各劑量組、阿斯美組大鼠咳嗽次數與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。提示不同劑量蟬芩顆粒與阿斯美均可在一定程度上降低大鼠咳嗽次數。模型組大鼠咳嗽潛伏期較空白組明顯縮短，差異有統計學意義（P＜0.01）；蟬芩顆粒各劑量組、阿斯美組大鼠咳嗽潛伏期延長，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。說明蟬芩顆粒、阿斯美均可在一定程度上緩解咳嗽激發實驗誘發的咳嗽，改善咳嗽敏感性。見表2。

表2 給藥14 d后咳嗽激發實驗咳嗽情況比較Table 2 Comparison of the cough status in various groups after medication for 14 days （）

表2 給藥14 d后咳嗽激發實驗咳嗽情況比較Table 2 Comparison of the cough status in various groups after medication for 14 days （）

①P＜0.01，與空白組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別空白組模型組蟬芩顆粒低劑量組蟬芩顆粒中劑量組蟬芩顆粒高劑量組阿斯美組咳嗽潛伏期（t/s）29.50±1.87 11.50±1.05①17.33± 1.21①②19.67± 2.34①②15.83± 2.40①②19.17± 1.17①②N/只6 6 6 6 6 6 10 min咳嗽次數（n/次）9.67±1.37 36.17±1.17①32.50± 1.87①②29.67± 1.86①②34.00± 1.67①②30.67± 1.63①②

2.2 各組血清SP值比較 模型組血清中SP值較空白組顯著升高（P＜0.01），說明造模成功；治療后蟬芩顆粒各劑量組、阿斯美組血清中SP值低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.01）。提示不同劑量蟬芩顆粒與阿斯美均可減少血清中SP的釋放。各給藥組組間血清中SP值差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.3 RT-PCR檢測大鼠肺組織和背根神經節COX-2、EP3、TRPV1 mRNA表達的結果

2.3.1 各組大鼠肺組織中COX-2、EP3、TRPV1 mRNA表達的比較 與空白組比較，模型組肺組織中COX-2 mRNA表達增高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，蟬芩顆粒高劑量組COX-2 mRNA表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示高劑量蟬芩顆粒可降低感染后咳嗽大鼠肺組織COX-2 mRNA水平。與空白組比較，模型組肺組織中EP3 mRNA表達增高，差異有統計學意義（P＜0.01）；蟬芩顆粒低、中、高劑量組及阿斯美組EP3 mRNA表達水平低于模型組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與空白組比較，模型組肺組織中TRPV1 mRNA表達增高，差異有統計學意義（P＜0.01）；蟬芩顆粒各劑量組、阿斯美組肺組織TRPV1 mRNA表達低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.01）。提示蟬芩顆粒、阿斯美均可降低感染后咳嗽大鼠肺組織中TRPV1 mRNA表達水平。見表4。

表3 各組血清SP值比較Table 3 Comparison of the serum SP values in various groups[，ρ/（pg·mL-1）]

表3 各組血清SP值比較Table 3 Comparison of the serum SP values in various groups[，ρ/（pg·mL-1）]

①P＜0.01，與空白組比較；②P＜0.01，與模型組比較。F=27.987

SP 399.99±23.37 533.94±14.01①439.07± 23.28①②439.32± 20.72①②422.91±23.43②435.27± 21.45①②組別空白組模型組蟬芩顆粒低劑量組蟬芩顆粒中劑量組蟬芩顆粒高劑量組阿斯美組N/只6 6 6 6 6 6

表4 各組大鼠肺組織COX-2、EP3、TRPV1 mRNA相對表達量的比較Table 4 Comparison of the mRNA relative expression levels of COX-2，EP3 and TRPV1 in lung tissue of various groups （）

表4 各組大鼠肺組織COX-2、EP3、TRPV1 mRNA相對表達量的比較Table 4 Comparison of the mRNA relative expression levels of COX-2，EP3 and TRPV1 in lung tissue of various groups （）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型組比較

TRPV1 mRNA 1.00±0.05 2.14±0.17②1.80±0.09②④1.78±0.11②④1.73±0.12②④1.76±0.12②④63.419組別空白組模型組蟬芩顆粒低劑量組蟬芩顆粒中劑量組蟬芩顆粒高劑量組阿斯美組F N/只6 6 6 6 6 6 COX-2 mRNA 1.01±0.14 1.69±0.11②1.62±0.16②1.58±0.12②1.51±0.18②③1.59±0.15②15.575 EP3mRNA 1.01±0.12 1.27±0.11②1.26±0.14①1.25±0.11②1.19±0.09①1.26±0.15①4.098

2.3.2 各組大鼠背根神經節中COX-2、EP3、TRPV1 mRNA表達的比較 與空白組比較，模型組背根神經節中COX-2 mRNA表達水平增高，差異有統計學意義（P＜0.01）；蟬芩顆粒高劑量組COX-2 mRNA表達水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。與空白組比較，模型組背根神經節中EP3 mRNA表達水平增高，差異有統計學意義（P＜0.01）；蟬芩顆粒低、中、高劑量組、阿斯美組EP3 mRNA表達水平低于模型組，但各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。與空白組比較，模型組背根神經節中TRPV1 mRNA表達水平增高，差異有統計學意義（P＜0.01）；蟬芩顆粒低、中、高劑量組TRPV1 mRNA表達水平低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。見表5。

表5 各組大鼠背根神經節COX-2、EP3、TRPV1 mRNA相對表達量的比較Table 5 Comparison of the mRNA relative expression levels of COX-2，EP3 and TRPV1 in dorsal root ganglion of various groups （，p）

表5 各組大鼠背根神經節COX-2、EP3、TRPV1 mRNA相對表達量的比較Table 5 Comparison of the mRNA relative expression levels of COX-2，EP3 and TRPV1 in dorsal root ganglion of various groups （，p）

①P＜0.01，與空白組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

TRPV1 mRNA 1.00±0.72 2.69±0.10①2.54± 0.13①②2.47± 0.14①③2.29± 0.12①③2.55±0.14①166.318組別空白組模型組蟬芩顆粒低劑量組蟬芩顆粒中劑量組蟬芩顆粒高劑量組阿斯美組F N/只6 6 6 6 6 6 COX-2 mRNA 1.00±0.07 2.07±0.09①2.05±0.10①1.99±0.07①1.93± 0.13①②2.01±0.11①110.412 EP3 mRNA 1.00±0.08 1.77±0.08①1.72±0.11①1.72±0.10①1.71±0.11①1.70±0.13①49.731

2.4 Western Blot檢測大鼠肺組織和背根神經節TRPV1蛋白表達的結果 與空白組比較，模型組肺組織和背根神經節TRPV1蛋白表達升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，蟬芩顆粒各劑量組、阿斯美組肺組織和背根神經節TRPV1蛋白表達降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；蟬芩顆粒中、高劑量組及阿斯美組TRPV1蛋白表達較蟬芩顆粒低劑量組降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表6、圖1。

2.5 各組大鼠肺組織HE染色結果 空白組：肺泡上皮完整，未見明顯病理改變，見圖2-a。模型組：肺泡間隙增厚，伴大量中性粒細胞等炎性細胞浸潤，見圖2-b。蟬芩顆粒低劑量組可見肺泡上皮細胞少量脫落，中性粒細胞浸潤，見圖2-c。蟬芩顆粒中劑量組肺泡間隙稍增厚，少量炎性細胞浸潤、中性粒細胞浸潤，見圖2-d。蟬芩顆粒高劑量組可見肺泡間隙稍增厚，有少量淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，見圖2-e。阿斯美組：肺泡間隙增厚，伴少量淋巴細胞、中性粒細胞浸潤，肺泡組織結構未見明顯損傷，見2-f。

表6 各組大鼠肺組織、背根神經節TRPV1蛋白表達Table 6 Comparison of the protein expression levels of TRPV1 in lung tissue and dorsal root ganglion of various groups （，p）

表6 各組大鼠肺組織、背根神經節TRPV1蛋白表達Table 6 Comparison of the protein expression levels of TRPV1 in lung tissue and dorsal root ganglion of various groups （，p）

①P＜0.01，與空白組比較；②P＜0.01，與模型組比較；③P＜0.01，與蟬芩顆粒低劑量組比較

背根神經節0.108±0.023 0.982±0.124①0.756±0.044①②0.616 ± 0.078①②③0.590 ± 0.054①②③0.544 ± 0.072①②③93.546組別空白組模型組蟬芩顆粒低劑量組蟬芩顆粒中劑量組蟬芩顆粒高劑量組阿斯美組F N/只6 6 6 6 6 6 TRPV1/GAPDH肺組織0.094±0.016 0.918± 0.151①0.771± 0.103①②0.388 ± 0.074①②③0.428 ± 0.074①②③0.593 ± 0.057①②③65.208

圖1 各組大鼠肺組織和背根神經節TRPV1蛋白Western Blot條帶Figure 1 Comparison of the Western Blot strips of TRPV1 in lung tissue and dorsal root ganglion of various groups

3 討論

圖2 各組大鼠肺組織病理變化比較（HE染色，×400）Figure 2 Comparison of the pathological features of lung tissue in various groups（by HE staining，×400）

感染后咳嗽的咳嗽反射主要受2種不同類別的感覺傳入神經纖維控制，分別為有髓鞘Aδ纖維和無髓鞘C纖維，而大于90%含速激肽的傳入纖維是C纖維，其神經元胞體源于頸神經節[12]。C纖維最顯著的特征是纖維末梢上有TRPV1的功能性表達。TRPV1又稱辣椒素受體，是瞬時受體電位通道蛋白的超家族成員之一，在中小型神經纖維有著較高的表達，在人組織的血管平滑肌、支氣管上皮細胞也有表達[13]。TRPV1可被體內多種炎癥因子激活，其中以PGE2為主的炎癥因子可降低TRPV1的活化閾值從而增加它的敏感性[14]。

COX-2是催化花生四烯酸氧化反應的限速酶，也是炎癥部位的主要環氧化物酶，與神經源性炎癥密切相關。PGE2是COX-2的主要產物，也是COX-2發揮生物學作用的主要信使。有研究認為PGE2激活TRPV1的主要途徑是與EP3受體結合，通過EP3受體耦聯的G蛋白傳導信號，然后經過CAMP/PKA機制激活和增敏TRPV1，產生鈣離子內流引起沖動，釋放SP等速激肽，形成神經源性炎癥[4-5]。可見COX-2誘導PGE2分泌，對TRPV1具有激動作用，COX-2有可能成為治療感染后咳嗽的重要靶點。

本研究結果顯示，模型組大鼠血清SP值、肺組織和背根神經節中COX-2、EP3、TRPV1表達升高，說明煙熏結合內毒素滴鼻及辣椒素刺激造模可通過促進大鼠COX-2表達升高，使PGE2的重要受體EP3表達增加，通過增加氣道C纖維興奮性激活TRPV1通道，從而激活蛋白激酶A釋放SP等速激肽類物質，導致氣道神經源性炎癥。治療后，蟬芩顆粒組血清SP值下降、肺和背根神經節中COX-2 mRNA表達下調、節中EP3受體mRNA表達無明顯變化、TRPV1 mRNA及蛋白表達均下調，提示蟬芩顆粒可通過下調感染后咳嗽大鼠肺組織和背神經根節COX-2及TRPV1表達，減少速激肽SP的釋放，從而減輕氣道神經源性炎癥。

蟬芩顆粒各劑量組大鼠肺和背根神經節中EP3 mRNA表達水平與模型組比較，差異無顯著性，但表現出一定的下調趨勢。其原因分析有二：一是樣本量較小，導致差異不明顯；二是介導PGE2生物學效應的EP受體有4種亞型，EP1和EP3受體均可增加細胞外鈣離子內流[15]，從而發揮相應的生物學效應。從目前實驗結果看，需要擴大樣本量以進一步觀察變化趨勢，且需要觀察蟬芩顆粒對其他EP受體的作用，以更好地了解蟬芩顆粒對感染后咳嗽的作用機制。