響應面法優化堿煉工藝脫除玉米油中玉米赤霉烯酮的研究

王英丹，馬傳國,2*，黃偉鋒，李利君,2，劉 偉，陳小威，陳復生

1.河南工業大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001 2.河南工業大學 小麥和玉米深加工國家工程實驗室，河南 鄭州 450001

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)又稱F-2毒素，分子式為C18H22O5，熔點為165 ℃，ZEN的化學結構式如圖1所示[1]。從圖1可以看出，ZEN的大環內酯結構占總分子結構的比例較高，因而極性較弱。ZEN幾乎不溶于水、四氯化碳等強極性或非極性溶劑，但在堿性溶液中溶解度較好，在乙腈、甲醇、二氯甲烷等有機溶劑中溶解度良好[2]。研究表明，ZEN具有類雌激素作用，對人和動物有一定的生殖毒性，還會產生細胞毒性和遺傳毒性，損傷肝腎并降低免疫機能，其毒性與暴露的水平、攝入量直接相關[3-4]。

圖1 玉米赤霉烯酮的化學結構式Fig.1 Chemical structure of zearalenone

玉米是我國的主要糧食作物之一，以玉米胚芽為原料生產的玉米油含有多種不飽和脂肪酸、甾醇、生育酚、亞麻酸等生物活性物質，玉米油中人體必需脂肪酸亞油酸的含量達到46%～60%[5-7]。玉米油因具有預防動脈硬化、調節血脂的功效及營養價值高而成為人們越來越關注的營養保健油脂[8]。調查研究表明，玉米及其深加工產品受ZEN的污染較為嚴重[9-10]。周建川等[11]對2017年我國飼料原料中真菌毒素的污染調查發現，玉米和玉米副產物中ZEN的檢出率分別為80.25%和88.89%，超標率分別達到2.47%和28.89%。張毅等[12]對2017年天津市售100份植物油進行了真菌毒素污染情況的調查，發現ZEN的檢出率為53.00%，最高含量為384.89 μg/kg。由于玉米油的生產原料多為工廠生產的副產物，不利的加工和貯藏條件使其受到真菌污染的可能性大大增加。此外，ZEN極性較弱，極易從玉米胚芽遷移富集至玉米油中，造成玉米油被真菌污染，對其食用安全造成巨大隱患[13-14]。目前許多物理、化學和生物方法被用于減少、去除或破壞ZEN[15-17]。裴婭曉等[18]采用正交試驗得到脫除ZEN的最佳條件:堿液質量分數為5.11%，超量堿用量為0.4%， 堿煉溫度為55 ℃，ZEN脫除率為94.63%。劉玉蘭等[19]采用吸附法對玉米油中ZEN的脫除進行了研究，WY1活性炭的效果最好，毛油中ZEN的含量從8 026.67 μg/kg降低至4 153.77 μg/kg，脫除率為48.25%。王月華等[20]以玉米胚芽為原料，研究了壓榨及毛油精煉過程對ZEN的影響，壓榨、堿煉和脫臭工藝對ZEN的脫除率分別達到了55.68%、44.00%、55.77%。由于ZEN是一種大環內酯結構的化合物，在堿性條件下其內酯鍵將部分打開[9,21]，因此，在采用化學方法時，受污染的糧食作物可通過ZEN與堿的化學作用降低其含量[22]。在油脂精煉過程中，堿煉脫酸是利用堿中和油脂中的游離脂肪酸，所生成的皂吸附部分其他雜質而從油中沉降分離ZEN[23]。在堿煉過程中，整個系統處于堿性狀態，ZEN與堿反應結合水洗能降低其毒性[24]。相比于其他方法，堿煉脫除ZEN不需要添加新的工藝程序及設備，能夠極大地降低生產成本，提高油脂的安全性能。

作者以加標處理后受到ZEN污染的玉米毛油為研究對象，在實驗室條件下對其進行堿煉脫酸試驗，以ZEN脫除率為指標，考察堿液質量分數、超量堿用量、堿煉初溫對 ZEN 脫除率的影響，并在單因素試驗的基礎上進行響應面試驗，優化玉米油堿煉脫酸工藝，最大程度降低玉米油中的ZEN含量，從而確定最有效的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米毛油(進行加標處理)：山東三星集團，磷脂2.965 mg/g，酸值6.3 mg/g，過氧化值3.57 mmol/kg；ZEN標準品：Sigma公司；氫氧化鈉：分析純；乙腈、甲醇：色譜純；ZEN 免疫親和柱：北京康源泰博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AUY-220型電子分析天平：日本SHIMADZU公司；HH-4型數顯攪拌水浴鍋：常州丹瑞實驗儀器設備有限公司；L550臺式大容量離心機：湘儀離心機儀器有限公司；Cary Eclipse 熒光分光光度計：美國瓦里安公司；Agilent1260高效液相色譜儀(配有1260FLD檢測器)：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米赤霉烯酮的檢測方法

標準溶液的配制：將50 μg/mL的ZEN標準品溶液用色譜乙腈分別稀釋配制成質量濃度為20、50、100、200、500、1 000 ng/mL的標準工作液，于-20 ℃密封保存。

樣品的前處理方法參考GB 5009.209—2016《食品中玉米赤霉烯酮的測定》。

色譜條件：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；預柱8 mm×12 mm，5 μm)流動相為乙腈和水(體積比為55∶45)；流速1 mL/min;柱溫25 ℃；進樣量20 μL；熒光檢測器。

1.3.2 玉米毛油水化脫膠

玉米毛油經熱過濾后稱取一定量毛油于燒杯中，置于數顯式水浴鍋中加熱攪拌。采用中溫水化脫膠工藝，將毛油加熱至60～65 ℃后，加快攪拌速率，加入油質量0.05%的磷酸反應一定時間，除去非水化磷脂，之后加入磷脂含量3倍的水(與毛油溫度接近)，逐滴加入油中，保持該溫度和轉速攪拌0.5 h左右，隨后降低攪拌轉速使膠體集聚變大，待膠雜與油呈明顯分離狀態時停止攪拌，將樣品轉移至離心桶中，離心脫水干燥。

1.3.3 玉米毛油堿煉脫酸

根據玉米脫膠油的酸值，選擇中溫脫酸條件，將脫膠油加熱到初溫55 ℃，加快攪拌速率，根據酸值以及堿液質量分數將計量好的堿液加熱至溫度與油溫接近，緩慢加入油中反應10 min后，升至堿煉終溫70 ℃，降低攪拌速率，至油皂明顯分離時停止攪拌。將油樣轉移至離心桶中以4 000 r/min離心20 min，上層凈油經熱水洗滌至中性后于95 ℃真空減壓條件下脫水干燥。

1.3.4 玉米油酸值的測定

酸值的測定按照 GB 5009.229—2016 方法進行。

1.3.5 單因素試驗

采用1.3.3的方法對脫膠玉米油進行堿煉，通過單因素試驗，分別考察了堿液質量分數、超量堿用量、堿煉初溫對ZEN含量的影響，通過分析確定其每個因素的最優條件。

1.3.6 響應面試驗設計

根據玉米油堿煉單因素試驗結果和Box-Behnken中心組合試驗設計原理，設計三因素三水平的響應面試驗。選擇堿液質量分數(A)，超量堿用量(B)、堿煉初溫(C)作為優化條件，以ZEN脫除率為評價指標，建立數學模型，優化堿煉工藝。

1.3.7 ZEN脫除率計算公式

式中：M1為玉米脫膠油ZEN含量;M2為玉米脫酸油ZEN含量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

將標準溶液置于熒光分光光度計中，確定檢測波長為激發波長271 nm，發射波長462 nm。在此條件下，調節流動相比例和流速，最終確定流動相比例為V乙腈∶V水=55∶45，流速1 mL/min。

將配置好的一系列質量濃度的標準溶液進行HPLC-FLD檢測，繪制標準曲線見圖2。標準曲線的方程為y=0.013 4x+0.117 0，R2=0.999 9，該方法的ZEN檢出限為5 μg/kg，定量限為20 μg/kg，可以較為準確、靈敏地測定ZEN的含量。

圖2 ZEN的標準曲線Fig.2 Standard curve of ZEN

2.2 堿煉脫除ZEN的單因素試驗

玉米毛油經水化脫膠得到的水化脫膠油酸值為6.2 mg/g，脫膠油的ZEN含量為6 816.52 μg/kg。

2.2.1 堿液質量分數對ZEN含量的影響

反應條件為反應初始溫度55 ℃，終溫比初始溫度高15 ℃，超量堿用量為油脂質量的0.2%，堿液質量分數分別為2%、5%、8%、11%、14%，考察堿液質量分數對ZEN含量的影響，結果如圖3所示。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，圖4、圖5同。圖3 堿液質量分數對油脂中ZEN脫除效果的影響Fig.3 Effect of alkali mass fraction on ZEN removal from corn oil

從圖3可以看出，隨著堿液質量分數的增加，油脂中ZEN的含量先降低后增加，當堿液質量分數為2%～5%時，由于堿液質量分數較低，堿優先與游離脂肪酸發生反應形成皂膜，部分堿液被包裹在皂膜中，阻礙了堿液與ZEN的充分接觸反應。而當堿液質量分數為10%～14%時，由于堿液質量分數過大，加入堿液的體積較少，從而容易形成局部堿液質量分數過高，造成中性油的損失，以及有些區域堿液過少，堿液與ZEN的接觸面積不夠大，不利于ZEN與堿液的充分接觸以及脫除。而當堿液質量分數為5%～8%時，由于堿液質量分數適中，堿液在油脂中分散均勻，且被皂膜包裹的堿液由于內外形成濃度差不斷擴散到皂膜外層，繼續與脂肪酸或者ZEN反應，所以堿液質量分數在此范圍內對ZEN的脫除效果最好。當堿液質量分數為8%時，脫酸油中殘留ZEN含量最低。因此，選最適宜的堿液質量分數為8%。

2.2.2 超量堿用量對ZEN含量的影響

反應條件為反應初始溫度55 ℃，終溫比初始溫度高15 ℃，堿液質量分數8%，超量堿用量為油脂質量的0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%，考察超量堿用量對ZEN含量的影響，結果如圖4所示。

圖4 超量堿用量對油脂中ZEN脫除效果的影響Fig.4 Effect of excess alkali content on ZEN removal from corn oil

從圖4可以看出，隨著超量堿用量的增加，油脂中ZEN含量先減少后趨于平穩。這是由于添加的堿液越多，與ZEN接觸反應的絕對堿量就越大。在超量堿用量達到0.2%時，油脂中殘留的ZEN含量遠低于初始含量，脫除率達到98.47%，繼續添加超量堿用量，ZEN的脫除率沒有明顯變化，說明添加0.2%的超量堿已經能夠使油脂中的ZEN與堿充分接觸反應。由于超量堿用量過多會造成中性油的損失，影響油脂得率，所以選擇最適宜超量堿用量為油脂質量的0.2%。

2.2.3 堿煉初溫對ZEN含量的影響

反應條件為堿液質量分數8%，超量堿用量為油脂質量的0.2%，反應初始溫度分別為35、45、55、65、75 ℃，堿煉終溫比初溫高15 ℃，考察堿煉初溫對ZEN含量的影響，結果如圖5所示。

圖5 堿煉初溫對油脂中ZEN脫除效果的影響Fig.5 Effect of alkali refining temperature on ZEN removal from corn oil

從圖5可以看出，油脂中ZEN含量在堿煉初溫為35～55 ℃均較低，增加堿煉溫度，油脂中ZEN的含量增加，其原因之一可能是油脂中游離脂肪酸的含量遠大于ZEN的含量，游離脂肪酸比ZEN的酯更容易發生酸堿中和反應，隨著堿煉溫度的升高，可能更加有利于油脂中的游離脂肪酸與堿發生反應，有利于皂腳的形成；另一個原因可能是隨著溫度的升高，ZEN在油脂中的溶解度增加，使得油脂中殘留的ZEN含量增加[25]。

2.3 響應面優化堿煉脫除ZEN工藝條件

根據單因素試驗結果和Box-Behnken中心組合試驗設計原理，設計三因素三水平的響應面試驗。選擇堿液質量分數(A)、超量堿用量(B)、堿煉初溫(C)作為優化條件，ZEN脫除率為指標。因素與水平見表1，響應面試驗設計與結果見表2。

表1 響應面因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2.3.1 回歸模型建立及方差分析

采用Design-Expert 軟件，對表2的試驗結果進行方差分析，如表3所示。

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface experiments

表3 方差分析 Table 3 Analysis of variance

注：**為極顯著(P<0.01)。

由表3可知，堿煉過程ZEN脫除率的二階模型回歸顯著(P<0.000 1)，失擬項不顯著(P=0.052 8)，并且該模型的R2=0.998 3，表明自變量與響應值之間的模型關系顯著，該模型能夠解釋99.83%的響應值變化，說明該回歸方程與實際情況擬合良好，可以用此模型來分析和預測堿煉過程的ZEN脫除率。從F值可知，3個因素對ZEN的脫除率影響為C>A>B，即堿煉初溫>堿液質量分數>超量堿用量。對模型各項進行方差分析可知，除了交互項AB對堿煉ZEN脫除率的影響不顯著外，模型中的一次項A、B、C，交互項AC、BC、A2、B2、C2對ZEN脫除率的影響均極顯著(P<0.01)。

2.3.2 響應面分析

由圖6可知，當超量堿用量一定時，ZEN的脫除率隨著堿液質量分數的增加先增加后減少，當堿液質量分數一定時，ZEN的脫除率隨著超量堿用量的增加先增加而后趨于穩定，與單因素試驗的趨勢相同。由此可知，堿液質量分數與超量堿用量的交互作用不明顯。

圖6 堿液質量分數與超量堿用量的交互作用Fig.6 Interaction between alkali mass fractionand excess alkali content

由圖7可知，當堿煉初溫一定時，隨著堿液質量分數的增加，ZEN的脫除率先增加后降低，但是當堿煉初溫較高時，ZEN的脫除率隨著堿液質量分數的增加降低幅度加大。同樣地，當堿液質量分數一定時，ZEN的脫除率隨著堿煉溫度的升高逐漸降低；堿液質量分數不同時，隨著堿液溫度變化，ZEN脫除率的變化率不同。由此可知，堿液質量分數和堿煉初溫存在交互作用。

圖7 堿液質量分數與堿煉初溫的交互作用Fig.7 Interaction between alkali mass fraction and initial temperature of alkali refining

圖8 超量堿用量與堿煉初溫的交互作用Fig.8 Interaction between excess alkali content and initial temperature of alkali refining

由圖8可知，當堿煉初溫一定時，隨著超量堿用量的增加，ZEN的脫除率先增加后趨于平緩；當超量堿用量一定時，隨著堿煉初溫的升高，ZEN脫除率先增加后減小，當超量堿用量較低時，隨著堿煉初溫的升高，ZEN脫除率的減小幅度要大于超量堿用量較高時ZEN脫除率隨堿煉初溫升高而減小的幅度，因此超量堿用量與堿煉初溫存在交互作用。

2.4 最佳堿煉工藝及驗證

以油脂ZEN脫除率為響應值，經過回歸擬合，得到試驗因素對ZEN脫除率的回歸方程：

Y(%)=97.58-6.89A+4.30B-10.77C+0.15AB-2.69AC+3.33BC-6.59A2-4.61B2-6.14C2。

經響應面優化的方程得到最佳反應條件為：堿液質量分數6.53%，超量堿用量為油脂質量的0.22%，堿煉初溫38.83 ℃。驗證試驗將堿煉初溫修改為39 ℃，在此條件下，ZEN的脫除率為(99.15±0.08)%,與試驗預測結果誤差較小，表明響應面優化所得的堿煉脫酸工藝條件是可行的。

3 結論

試驗結果表明，在油脂堿煉脫除ZEN的工藝中，不同的堿液質量分數、超量堿用量、堿煉初溫對ZEN的脫除率均有顯著影響。在單因素試驗的基礎上通過響應面優化試驗，建立了油脂堿煉脫除ZEN的數學模型，此模型能夠很好地預測ZEN在堿煉工藝中的脫除率。最佳工藝條件為：堿液質量分數6.53%，超量堿用量0.22%，堿煉初溫39 ℃，在此條件下ZEN的脫除率為(99.15±0.08)%，證明該工藝條件能有效地脫除玉米毛油中的ZEN，提高油脂的安全性。