羊乳中牛乳成分的直接實時環介導等溫擴增檢測

澹臺瑋，徐秦峰，馬西亞，張文娟

（陜西科技大學食品與生物工程學院國家羊乳制品加工技術研發專業中心，西安710021）

0引言

乳制品營養豐富，易被人體消化吸收，同時作為加工食品原輔料的重要來源，在世界各地有著巨大的消費群體[1]。尤其是羊乳以其更高的營養價值使得其價格遠高于牛乳[2]。一些不法商家為了尋求商業利益，在羊乳中摻入牛乳，以次充好，且摻入手段多樣，不易辨別。這種摻假行為不僅會給消費者造成直接的經濟損失，而且還涉及到某些特殊的醫療要求、食物過敏甚至是宗教信仰問題[3]。因此，建立牛、羊源性的品種鑒別方法以保證乳品真實性是必要的。

目前用于乳制品來源鑒別方法主要有分析蛋白、脂肪和核酸的方法，這些方法在一定程度上都可以實現牛、羊乳品種鑒別[4]。但是，相比于蛋白質和脂肪，核酸分子的穩定性更高，且在個體細胞間具有良好的保守性[5-6]。因此基于DNA的檢測方法不僅適用于生乳樣品，也適用于熱加工的乳品[7]。基于核酸發展的牛、羊乳的品種鑒別技術有普通PCR[8]、real-time PCR[9]等，但大多操作繁雜，設備昂貴，且需專業操作人員才能完成。Notomi等[10]研發的一種新型核酸擴增方法，即環介導等溫擴增技術（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）通過4條特異性引物，快速識別靶序列上的6個位點，結合具有鏈置換活性的DNA聚合酶，實現在恒溫條件下，特異、高效、快速地擴增核酸序列，已被成功應用于物種鑒定。Deb R等[11]通過對LAMP反應體系進行優化，實現在2 h內對羊奶/肉類樣品中摻入5%牛成分的檢測。Cho A R等[12]建立了LAMP熔解曲線分析方法，實現對8種肉制品進行了識別和鑒定。然而，這些研究都需要進行過程繁瑣、耗時較長的DNA提取過程，限制了對現場快速檢測的應用。本研究建立了一種在不進行DNA提取的情況下直接實時LAMP檢測方法，同時檢測時可以采用更少量的樣品，實現對羊乳及其制品中摻入牛乳成分的檢測。

1材料與方法

1.1實驗材料

鮮奶牛乳樣品，西安市未央區草灘奶牛場；鮮羊乳樣品-20℃保存備用，市售；用于驗證引物特異性的非目標DNA（雞、豬、馬、兔和鴿子）均購于四川華漢三創有限公司；不同品牌的羊乳產品（液態乳、羊奶片、全脂羊乳粉、淡奶粉及配方奶粉），市售，用于驗證所建立方法的實際應用價值。

模擬摻假樣品的制備：將牛乳按不同比例摻入羊乳中（100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%、0%），制備成具有不同含量的模擬摻假樣品。

1.2主要試劑和儀器

(1)試劑：磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒購自天根有限公司；甜菜堿（Sigma公司）；dNTP混合液，Bst 2.0 WarmStar DNA聚合酶，MgSO 4，均采自New England Biolabs。

(2)儀器：高速冷凍離心機（5424R），Eppendorf有限公司；瓊脂糖水平電泳儀（DYCP-31DN），北京六一生物科技有限公司；電熱恒溫水槽（DK-8D），上海精宏實驗設備有限公司，熒光定量PCR儀（qTOWER 2.2），德國耶拿分析儀器股份公司；超微量分光光度計（Q 6000），美國Quawell。

1.3 DNA提取

按照磁珠法血液基因組DNA提取試劑盒說明書，提取新鮮乳品或乳粉中的DNA，采用超微量核酸定量儀測定DNA的濃度和純度后，將DNA溶液稀釋到7 ng/μL，保存于-20℃冰箱中備用。

1.4 LAMP引物設計及篩選

本研究涉及的牛、羊特異性引物以線粒體保守序列為靶基因，依據引物設計原則使用PrimerExplorerV4在線設計并進行實驗的可行性驗證，經過多次設計及篩選比對，最終使用SN/T 4419.21-2016[13]標準中的牛特異性引物及文獻報道的羊特異性引物[14]，如表1所示。引物由生工生物(上海)有限公司合成。

1.5 LAMP反應體系建立

LAMP反應體系為10μL，包括:1μL 10×Thermol Pol buffer，外引物F3和B3（10μmol/L）各0.2μL，內引物FIP和BIP（40μmol/L）各0.2μL，1.4μL dNTPs（10 mmol/L），1.6μL甜菜堿（0.8M），0.4μL MgSO 4（100 mmol/L），0.4μL Bst DNA聚合酶（8 U/μL），20×Eva Green熒光染料0.25μL，加入待測DNA 1.2μL，以超純水為空白對照，最后用水補齊到10μL，混勻。反應條件：64℃恒溫反應45 min。

表1本實驗中LAMP擴增引物序列

1.6直接實時LAMP反應體系建立

對于直接實時LAMP反應體系，所有的待測樣品都不需要進行DNA提取。首先取5μL樣品（對市售的羊奶粉，取0.1 g奶粉溶于1 mL水中混勻，制成液態乳）放入含有55μL磷酸鹽（PBS）緩沖液的PCR反應管中，在98℃下孵育5 min，然后取1.2μL上層清液直接作為模板用于上述LAMP反應。

1.7特異性試驗

分別提取牛、羊、雞、豬、馬、兔、鴿子的DNA為模板，按照LAMP體系配置反應液，加入不同模板DNA，在最適反應溫度下擴增，結果通過擴增曲線及2%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析鑒定，以驗證LAMP引物的特異性。

1.8靈敏度試驗

將DNA提取液進行10倍梯度稀釋，使反應體系中DNA濃度分別為7、0.7、0.07、0.007、0.0007、0.00 007 ng/μL，將每個梯度的稀釋液取1.2μL作為模板進行LAMP反應檢測，并建立標準曲線進行單個物種DNA檢測靈敏度的測定。

2結果與分析

2.1特異性檢測

采用牛、羊、雞、豬、馬、兔、鴿子等樣品DNA為模板，進行LAMP反應，以驗證引物的特異性，擴增曲線如圖1所示，針對牛、羊源性成分設計的特異性引物，僅含有目標成分DNA檢測結果為陽性，空白對照和其他動物源性樣品均未發生擴增，結合凝膠電泳結果顯示，只有牛、羊乳DNA中分別加入牛、羊特異性引物才出現典型的梯形條帶（圖1中的泳道1），與擴增曲線結果一致，表明LAMP引物的特異性良好。

2.2靈敏度檢測

為了確定設計的LAMP方法能夠檢測到的牛、羊乳DNA的含量，將10倍稀釋的牛、羊源性成分DNA（7 ng/μL、0.7 ng/μL、0.07 ng/μL、0.007 ng/μL、0.0 007 ng/μL、0.00 007 ng/μL）分別用于LAMP反應，以超純水作為空白對照。圖2結果表明，牛源性成分檢測的靈敏度可達到0.07 pg/μL，羊源性成分檢測的靈敏度可達到0.7 pg/μL，表明檢測體系具有較高的靈敏度。同時，牛、羊源性成分濃度與LAMP方法檢出時間具有良好的線性關系，隨著模板DNA濃度的降低，其檢出時間越長。

圖1牛、羊源性成分LAMP引物特異性驗證

圖2牛、羊源性成分LAMP反應靈敏度檢測

2.3實時LAMP技術對摻假樣品檢測

考慮牛源性成分為羊乳中最為常見的摻假成分，為了確定其檢出限，將試劑盒提取的羊乳DNA稀釋液制成混合樣品（摻入牛乳DNA含量分別為100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%），使用牛特異性引物進行LAMP擴增。從圖3可以看出，以不同比例的DNA混合液為模板，均可以出現明顯的擴增曲線，表明本方法對羊乳中摻入牛源性成分的檢測限為0.1%。

圖3牛羊乳DNA混合樣品中牛源性成分分析（1～9分別為摻入牛乳DNA比例為100%、80%、50%、10%、5%、1%，0.1%、0%和空白對照）

2.4直接實時LAMP技術對摻假樣品檢測

為了驗證建立的直接實時LAMP方法的應用性，將牛乳按不同比例摻入羊乳中（100%、80%、50%、10%、5%、1%、0.1%、0%），制備成不同含量的混合樣品，每個樣品只需孵育5分鐘，使細胞裂解釋放出DNA，然后直接作為模板進行LAMP擴增。結果如圖4所示，建立的直接實時LAMP方法可成功對乳制品進行檢測，在不同比例的混合樣品中，該方法能檢測出羊乳中低至1%的牛乳成分，明顯低于由試劑盒提取的DNA制成混合樣品的檢出限。這是因為乳體系內部的復雜性和乳中體細胞含量分布的不均勻性，將乳混和直接進行擴增時會有部分損失。

圖4牛羊乳直接混合樣品中牛源性成分分析（1～9分別為摻入牛乳比例為100%、80%、50%、10%、5%、1%，0.1%、0%和空白對照）

2.5實際樣品檢測

為了驗證直接實時LAMP方法對市售樣品檢測的適用性，采用上述建立的檢測體系對10種商業乳品進行直接檢測，并通過試劑盒提取DNA的實時LAMP方法驗證其準確性，檢測結果見表2。結果表明，三個商業乳品(樣品1、2、3)標記為只含有羊乳被加有牛特異性引物的LAMP反應體系擴增，顯示了在羊乳中不同程度的摻入牛乳成分；而標識有生羊乳、乳清粉的樣品8僅檢測出牛乳成分，與標識的主成分不符。盡管牛乳清粉在羊奶粉中的添加和替換一直存在，但是錯誤標注會對過敏人群造成危害[15-16]。同時，直接實時LAMP與經DNA提取的實時LAMP反應相比，結果完全一致，但檢測時間均有延遲，根據Tanner N A等人[17]對實時LAMP檢測研究表明，在某些引物不足或不純樣品（即樣品直接作為模板擴增）情況下時間閾值范圍可在45-60 min，即為陽性結果，對比該研究表2可以發生擴增反應的時間可作為判定方式，即時間閾值小于60 min，為陽性結果，反之，則為陰性。相較于通過試劑盒提取乳中DNA到LAMP結果檢測，簡化了實驗過程，縮短了時間。本實驗證明了直接實時LAMP方法在不提取DNA的情況下實現對牛羊乳成分進行檢測的能力，并且適用于現場快速檢測。因此，本研究可實現對市售羊乳制品中摻入牛源性成分的檢測。

表2市售羊乳制品中牛、羊乳成分的LAMP檢測

3結論

現如今，羊乳及其制品摻入牛源性成分鑒別是乳制品質量安全控制面臨的重要挑戰。根據標準NY/T 3050-2016《羊奶真實性鑒定技術規程》規定，基于DNA的PCR方法，適用于生羊奶、UHT滅菌液態羊奶及羊奶粉中摻入牛源性奶成分的定性檢測。但是該PCR方法需要專門的儀器以及復雜的DNA提取過程，無法實現羊奶真實性的現場快速檢測，限制了此方法的推廣應用。LAMP法作為一種新興分子生物學方法，無需復雜的熱循環體系，僅在恒溫條件下擴增，因其高效、快速、便捷的特點已應用于動物源性成分及多種致病菌的檢測[18-20]。本研究根據線粒體保守序列選取牛、羊特異性引物，建立了快速鑒別羊乳及其制品摻假的直接實時LAMP檢測方法，該方法具有良好的特異性，僅對含有目標成分的樣品有擴增，對其他動物源性成分沒有交叉反應。該方法對牛、羊源性成分的檢測靈敏度可達到0.07 pg/μL和0.7 pg/μL。對羊乳中摻入不同比例牛乳混合物進行5min熱處理，可檢測出摻入1%的牛乳，能夠滿足羊乳中摻入牛源性成分的檢測。通過對市售羊乳及其制品中摻入牛源性成分的檢測，無需核酸提取的直接實時LAMP檢測結果與實時LAMP技術結果相一致，在1 h內即可對樣品進行鑒定，極大地簡化了實驗過程，縮短了時間，同時直接實時LAMP技術無需核酸提取，減少了樣品DNA提取過程的污染風險，同時檢測時僅需采用更少量的樣品即可實現乳制品中牛、羊源性成分的現場快速檢測。