益生菌阿膠低肽復(fù)合乳飲料調(diào)配工藝

劉星，秦楠，李冠文，劉鍵輝，葉丹瑩，曹華麒

（山西中醫(yī)藥大學(xué)制藥與食品工程學(xué)院，太原030619）

0引言

阿膠富含有明膠、蛋白質(zhì)等多種有效成分，有增強免疫、抗疲勞、抗輻射等作用[1-2]。紅棗具有安神健脾、補腎等多種保健食療功能，一直以來被人們視為極佳滋補品[3-4]。韓雪等利用乳酸菌發(fā)酵紅棗汁發(fā)現(xiàn)，游離態(tài)酚酸含量顯著提高并表現(xiàn)出較強的抗氧化活性[5]。黑枸杞具有提高免疫、抗氧化、滋肝等功能[6]。楊潔與梁小軍分別從黑枸杞中提取總黃酮、多糖物質(zhì)，其抗氧化與免疫活性顯著提高[7-8]。林燕文等對乳酸菌發(fā)酵枸杞泡菜研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖可為乳酸菌提供碳源，提高產(chǎn)酸速度與產(chǎn)酸力[9]。基于阿膠低聚肽的研究，以牛奶、阿膠低肽粉、紅棗與黑枸杞液為發(fā)酵基液，優(yōu)化了復(fù)合乳飲料的配方，并對穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，為藥食同源原料的開發(fā)利用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

1實驗

1.1材料與儀器

紅棗，黑枸杞，阿膠，阿膠低肽粉（低肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58%）（實驗室自制）；雙歧桿菌（Bifidobacterium）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）∶嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)=1∶1；胃蛋白酶1×105 U/g，胰蛋白酶1×104 U/g，木糖醇，檸檬酸，復(fù)合香精（菠蘿香精：桔子香精=1∶1），瓜爾膠，黃原膠，蔗糖酯均為食用級。

RRHP-100萬能高速粉碎機，歐凱萊芙香港實業(yè)公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；SPT20消解爐，北京京通順康儀器有限公司；SPD 60自動定氮儀，北京三品科創(chuàng)儀器有限公司；GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；N-1100V-WD旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；DZF-6050真空干燥箱，嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司；DY04-13-44-00高壓滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1工藝流程

1.2.2操作要點

（1）阿膠低肽粉的制備。阿膠粉用超聲波輔助胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解，酶解條件為加酶量分別0.02 g、0.05 g，先后調(diào)節(jié)溫度45℃和42℃，p H值為2.0和8.0，時間2.5 h和3.5 h，酶解后將酶解液于100℃滅酶10 min，然后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，55℃濃縮至原體積的30%左右，冷凍干燥后即得阿膠低肽粉。

（2）復(fù)合發(fā)酵液的制備。以牛奶、阿膠低肽粉、紅棗和黑枸杞液為主原料，用雙歧桿菌與傳統(tǒng)乳酸菌作為發(fā)酵菌種，發(fā)酵工藝為牛奶、紅棗汁與黑枸杞汁體積比40∶20∶10(mL)，加水補足至100 mL，按5 g/100 mL添加阿膠低肽粉，菌種復(fù)配比（益生菌∶傳統(tǒng)乳酸菌=1∶1），接種量3%，蔗糖添加量2 g/100 mL，發(fā)酵溫度37℃，時間6 h。

（3）阿膠低肽復(fù)合乳飲料的制備。將復(fù)合發(fā)酵液用高速攪拌器攪拌破乳10 min，加入木糖醇、檸檬酸、及復(fù)合香精等進(jìn)行調(diào)配，并按一定比例添加穩(wěn)定劑，在85℃條件下殺菌15 min，冷卻后即得阿膠低肽復(fù)合乳飲料。

1.2.3阿膠低肽復(fù)合乳飲料調(diào)配的單因素實驗

感官評分為評價指標(biāo)，分別考察木糖醇、檸檬酸、蜂蜜及復(fù)合香精的添加量對復(fù)合乳飲料感官品質(zhì)的影響，不同因子梯度條件如表1所示。

表1單因素水平設(shè)計

1.2.4復(fù)合乳飲料響應(yīng)面優(yōu)化實驗

基于單因素試驗結(jié)果，選用中心組合實驗Box-Behnken設(shè)計方案，選取木糖醇、檸檬酸、復(fù)合香精添加量3個變量，以A，B，C表示；并以+1，0，-1分別代表其變量的水平，按方程x=(X-X 0)/△X對自變量進(jìn)行編碼。其中，x為變量的編碼值；X為變量的真實值；X 0為實驗中心點變量的真實值；△X為變量的步長變化；感官評分Y為響應(yīng)值，如表2所示。

1.2.5感官評價標(biāo)準(zhǔn)

表2響應(yīng)面實驗因素水平編碼 g

復(fù)合乳飲料感官評價依據(jù)中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)GB/T21732-2008《含乳飲料》及相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]，請20位均接受過《食品感官分析》課程培訓(xùn)的專業(yè)技術(shù)人員，按照表3感官評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價，具體評分標(biāo)準(zhǔn)如表3所示。

表3復(fù)合乳飲料感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6正交優(yōu)化穩(wěn)定性實驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以感官評分為評價指標(biāo)，選擇瓜爾膠添加量（A）、黃原膠添加量（B）、蔗糖酯添加量（C）為主要因素，采用L 9（33）正交試驗設(shè)計，對各因素水平進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗因素與水平如表4所示。

表4復(fù)合乳飲料穩(wěn)定性正交試驗因素與水平 g

1.2.7阿膠低肽復(fù)合乳飲料穩(wěn)定性的評價標(biāo)準(zhǔn)

復(fù)合乳飲料屬多相體系，成分復(fù)雜，穩(wěn)定性是影響產(chǎn)品的主要因素[12-13]。將穩(wěn)定劑溶于熱水充分溶解后，與復(fù)合乳飲料按一定比例混勻，靜置24 h后觀察穩(wěn)定性，并對復(fù)合乳飲料的沉淀、乳清析出以及脂肪上浮等情況進(jìn)行評價，滿分100分，具體評分標(biāo)準(zhǔn)如表5所示。

1.3理化及微生物指標(biāo)測定

利用蘆丁、葡萄糖作為標(biāo)品，采用分光光度法對黃酮[14]及多糖[15]質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定；凱式定氮法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)[16]。

活菌數(shù)的測定：采用國標(biāo)GB 4789.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》中乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）培養(yǎng)基的方法對益生菌復(fù)合乳飲料乳酸菌數(shù)量進(jìn)行檢測，將樣品涂布接種到MRS培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)48 h后，計數(shù)[17]。

大腸菌群的測定：采用國標(biāo)GB 4789.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》中平板計數(shù)的方法對益生菌復(fù)合乳飲料的大腸桿菌數(shù)量進(jìn)行檢測，將樣品傾注接種到結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)48 h后,計數(shù)[18]。

1.5數(shù)據(jù)分析

表5復(fù)合乳飲料穩(wěn)定性的評分標(biāo)準(zhǔn)

本研究所有的試驗數(shù)據(jù)均使用Origin和Design-Expert（version8.0.6）統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運用最小差異顯著法（LSD）進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1阿膠低肽復(fù)合乳飲料單因素實驗

2.1.1木糖醇添加量對復(fù)合乳飲料感官質(zhì)量的影響

如圖1所示，隨木糖醇添加量的增加，感官評分呈先升后降的趨勢，由于木糖醇的增加，甜度增大導(dǎo)致飲料過甜，逐漸出現(xiàn)酸甜比不協(xié)調(diào)。因此，木糖醇添加量選擇4 g/100 mL為宜。

圖1木糖醇添加量對感官質(zhì)量的影響

2.1.2檸檬酸添加量對復(fù)合乳飲料感官質(zhì)量的影響

如圖2所示，隨檸檬酸添加量的增加，感官評分先增大后減少，飲料酸味逐漸增大，當(dāng)添加量大于0.15 g/100 mL時，評分呈下降趨勢，可能是過酸造成口感失調(diào)，因此，檸檬酸添加量選擇0.15 g/100 mL為宜。

圖2檸檬酸添加量對感官質(zhì)量的影響

2.1.3蜂蜜添加量對復(fù)合乳飲料感官質(zhì)量的影響

如圖3所示，感官評分隨蜂蜜添加量的增加呈逐漸增大而后下降趨勢，當(dāng)添加量為8 g/100 mL時達(dá)到最高，在此條件下，乳飲料香甜不膩，繼續(xù)添加蜂蜜，蜂蜜的味道會掩蓋其他風(fēng)味，表現(xiàn)出適度過高。因此，蜂蜜添加量選擇8 g/100 mL為宜。

2.1.4復(fù)合香精添加量對復(fù)合乳飲料感官質(zhì)量的影響

圖3蜂蜜添加量對感官質(zhì)量的影響

如圖4所示，感官評分隨著復(fù)合香精添加量的增加呈先上升再下降的趨勢，香味由淡逐漸突出，但當(dāng)添加量超過0.06 g/100 mL時，香精味濃厚，口感較差，因此，復(fù)合香精添加量選擇0.06 g/100 mL為宜。

圖4復(fù)合香精添加量對感官質(zhì)量的影響

2.2復(fù)合乳飲料響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

如表6所示，17個試驗點中12個是析因點，5個是零點，析因點是自變量取值在X 1，X 2，X 3所構(gòu)成的三維頂點，零點表示區(qū)域的中心點，其中重復(fù)零點實驗5次，用以估算試驗誤差。

2.2.2模型的建立及其顯著性檢驗

利用Design-Expert（version8.0.6）軟件對表3試驗數(shù)據(jù)通過多元回歸擬合，得到阿膠低肽復(fù)合乳飲料的感官評分（Y）對自變量木糖醇添加量（A）、檸檬酸添加量（B）、復(fù)合香精添加量（C）的回歸方程為

Y=93-1.5A-0.25B-2.5C+1.5AB-3.0AC+4.5BC-5.25A2-8.75B2-7.25C2。

由表7可以看出，模型F值為25.31，P＜0.0001，說明此模型極顯著，模型失擬項表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率，此模型失擬項P=0.5645＞0.05，表明模型不顯著，擬合概率高，運用到試驗中誤差小。該模型的相關(guān)系數(shù)R 2=0.9702，且模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.9319，說明此模型能用于93.19%的試驗結(jié)果解釋，進(jìn)一步說明了回歸方程的擬合程度較好。

由表7中的F值的大小可以判斷各因素對益生菌復(fù)合發(fā)酵乳飲料質(zhì)量影響的強弱，F(xiàn)值越大，說明該因素對于感官評價的影響程度越大。故根據(jù)上表可得出各因素對于復(fù)合乳飲料感官評價的影響程度大小依次為復(fù)合香精添加量（C）＞木糖醇添加量（A）＞檸檬酸添加量（B）。

表6 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)上述回歸方程繪制出響應(yīng)面圖，以確認(rèn)復(fù)合香精、木糖醇、檸檬酸添加量3個因素對復(fù)合乳飲料質(zhì)量的影響，如圖5所示。

圖5（a）所示，木糖醇-檸檬酸添加量對復(fù)合乳飲料感官評分的交互作用不顯著。隨著兩者添加量逐漸增加，感官評分先增大然后減小。由圖5（b）所示，木糖醇-復(fù)合香精添加量對感官評分的交互作用顯著（P＜0.05）。由圖5（c）所示，檸檬酸-復(fù)合香精添加量對感官評分的交互作用極顯著（P＜0.01），通過響應(yīng)面

圖5各因素交叉作用對復(fù)合乳飲料的感官評分影響的響應(yīng)面和等高線

表7回歸模型方差分析

分析，響應(yīng)面的坡度較陡。感官評分隨著兩者的提高而增加，當(dāng)檸檬酸達(dá)到0.16 g、復(fù)合香精達(dá)到0.07 g時增長趨勢變緩，開始呈現(xiàn)下降的趨勢。

2.2.3驗證實驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，最佳的制備工藝條件為木糖醇添加量1.96 g，檸檬酸添加量0.166 g，復(fù)合香精添加量0.076 g，在此條件下的感官評價得分為93.5分。考慮實際操作的方便性，將最適參數(shù)修正為：木糖醇添加量2 g，檸檬酸添加量0.15 g，復(fù)合香精添加量0.08 g，為了驗證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，重復(fù)實驗3次，所得平均值與理論預(yù)測值非常接近，且相對誤差小于2%，無顯著性差異（P＞0.05），說明重復(fù)性良好。

2.3正交優(yōu)化穩(wěn)定性實驗結(jié)果

由表8可以看出，各因素對感官影響的主次順序為C＞B＞A，即蔗糖酯的添加量復(fù)合乳飲料的穩(wěn)定性影響最大，依次是黃原膠、瓜爾膠添加量，最優(yōu)組合為A 1B2C 3，即瓜爾膠添加量為0.04 g/100 mL，黃原膠添加量為0.08 g/100 mL，蔗糖酯添加量為0.3 g/100 mL。在此最佳條件下，產(chǎn)品的感官評分為91分。由表9可知，因素A，B，C對穩(wěn)定性評分的影響均有顯著性差異（P＜0.05）。

表8復(fù)合乳飲料調(diào)配優(yōu)化正交實驗結(jié)果

表9正交實驗結(jié)果方差分析

2.4儲藏期內(nèi)益生菌復(fù)合乳飲料活菌數(shù)的變化

由圖6可以看出，益生菌復(fù)合乳飲料中活菌總數(shù)隨著儲藏時間的延長，在2～4 d期間菌數(shù)增長量大、增速快，隨著儲藏時間延長菌數(shù)逐漸下降，這可能與菌體代謝產(chǎn)物大量積累形成的酸性環(huán)境對其菌體本身產(chǎn)生抑制，或與菌體進(jìn)入老化、衰亡期導(dǎo)致負(fù)增長有關(guān)[17]。

2.5產(chǎn)品質(zhì)量評價

圖6儲藏期內(nèi)益生菌復(fù)合乳飲料活菌數(shù)的變化

2.5.1感官指標(biāo)

色澤：均勻一致，淺褐色。組織狀態(tài)：細(xì)膩、均勻，允許有少量乳清析出。滋味：酸甜適口，口感絲滑，有酸奶香氣，有清爽的紅棗與黑枸杞味，無異味。

2.5.2理化指標(biāo)

黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.54%，多糖為9.32%，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2.2±0.13 g/100 mL。

2.5.3微生物指標(biāo)

乳酸菌總數(shù)為3.6×107 mL-1；菌落總數(shù)＜100 mL-1；大腸菌群（最近似值）≤3 mL-1；致病菌未檢出。

3結(jié)論

牛奶、紅棗汁與黑枸杞液體積比40∶20∶10(mL)，添加阿膠低肽粉5 g/100 mL的基礎(chǔ)上，通過單因素和響應(yīng)面試驗確定了益生菌發(fā)酵復(fù)合乳飲料的最佳配方：木糖醇2 g/100 mL，檸檬酸0.15 g/100 mL，復(fù)合香精0.08 g/100 mL，蜂蜜8 g/mL。穩(wěn)定性作為影響生產(chǎn)的主要因素之一，在原料配比最優(yōu)基礎(chǔ)上，采用添加復(fù)配的穩(wěn)定劑的方式可有效防止出現(xiàn)分層、沉淀等現(xiàn)象。通過穩(wěn)定性實驗，選擇瓜爾膠0.04 g/100 mL，黃原膠0.08 g/100 mL，蔗糖酯0.3 g/100 mL。通過測定復(fù)合乳飲料理化指標(biāo)與微生物指標(biāo)，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.54%，多糖9.32%，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度2.2 g/100 mL。乳酸菌總數(shù)為3.6×107 mL-1，菌落總數(shù)＜100 mL-1，致病菌未檢出。終制得的成品具有獨特風(fēng)味，酸甜適宜，口感佳穩(wěn)定性好的保健乳飲料。

通過乳酸菌發(fā)酵，紅棗中游離酸酚、黃酮類物質(zhì)含量可顯著提高，具有較強的抗氧化活性，結(jié)合黑枸杞多糖抗氧化活性及增強免疫力活性，后期可通過動物模型對產(chǎn)品的功能活性進(jìn)一步驗證。