酶解-分光光度法測(cè)定乳粉中L-色氨酸含量

田洪蕓，王文特，王冠群，張海紅，提靖靚

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南250101）

0引言

L-色氨酸是人體必需的8種必需氨基酸之一，只能通過(guò)食物來(lái)攝取，人體日常飲食中缺乏L-色氨酸會(huì)出現(xiàn)與蛋白質(zhì)缺乏癥類似的癥狀。此外，L-色氨酸能促進(jìn)大腦神經(jīng)細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺，可緩解人體緊張情緒，改善人體睡眠，乳粉屬于L-色氨酸含量較為豐富的食物之一[1-4]。

L-色氨酸易溶于水或乙醇，不溶于氯仿、乙醚，在稀酸或稀堿中較穩(wěn)定。目前，我國(guó)還沒有針對(duì)乳粉中L-色氨酸測(cè)定的方法標(biāo)準(zhǔn)，GB 5009.124-2016《食品安國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)采用酸水解樣品，不適用于L-色氨酸的測(cè)定；國(guó)內(nèi)外測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)方法主要有分光光度法、電位滴定法和液相色譜法，其中分光光度法和液相色譜法是測(cè)定L-色氨酸的常用方法，上述方法均采用堿水解法處理樣品，但堿水解條件會(huì)導(dǎo)致乳粉中L-色氨酸的降解，不適用于乳粉檢測(cè)[5-11]。AOAC標(biāo)準(zhǔn)草案使用酶解法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中L-色氨酸[12]。本文參照AOAC標(biāo)準(zhǔn)L-色氨酸測(cè)定的酶解法前處理方法，建立了采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定乳粉中L-色氨酸的方法，經(jīng)驗(yàn)證，方法的穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高。

1原理

試樣經(jīng)蛋白酶酶解，在強(qiáng)酸性介質(zhì)中，氧化劑存在下，L-色氨酸的吲哚環(huán)與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，在一定范圍內(nèi)藍(lán)色化合物的吸光度值與L-色氨酸含量成正比，用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

2試劑和材料

2.1試劑和材料

市售全脂乳粉、標(biāo)準(zhǔn)乳粉1849a（NIST）；灰色鏈霉菌蛋白酶，XIV型,活力≥3.5 U/mg，德國(guó)西格瑪；甲醇，色譜純，國(guó)藥試劑；乙酸，國(guó)藥試劑；鹽酸，國(guó)藥試劑；Tris堿C 4H 11NO 3，國(guó)藥試劑；濃硫酸，國(guó)藥試劑；亞硝酸鈉，國(guó)藥試劑；對(duì)二甲氨基苯甲醛，國(guó)藥試劑；L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)：73-22-3）；電子分析天平，日本島津；紫外分光光度計(jì)，日本島津；p H計(jì)，梅特勒；恒溫培養(yǎng)箱，伯輝；離心機(jī)，轉(zhuǎn)速≥9 000 r/min，德國(guó)賀默。

2.2試劑配制

2.2.1 Tris緩沖液（0.1 mol/L，pH=8.5）

稱取6.0 g Tris堿于500 mL燒杯中，加水300 mL溶解，用1.0 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液的p H到8.5±0.05，將燒杯中的溶液轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，水定容至刻度，混勻。

2.2.2蛋白酶溶液（5 mg/mL）

稱量一定質(zhì)量的蛋白酶，用Tris緩沖液稀釋并定容，使蛋白酶濃度為5 mg/mL。注意不要搖動(dòng)，避免起泡。臨用現(xiàn)配，室溫下6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3硫酸溶液（21.2 mol/L）

量取589 mL硫酸，緩慢加入約350 mL水中，冷卻后用水稀釋至1 L。

2.2.4對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液（1%）

稱取1.00 g對(duì)二甲氨基苯甲醛用硫酸溶液溶解并定容至100 mL，臨用時(shí)現(xiàn)配。

2.2.5亞硝酸鈉溶液（0.2%）

稱取0.10 g亞硝酸鈉，溶解于50 mL水中，臨用時(shí)現(xiàn)配。

2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.3.1 L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100μg/mL）

稱取25 mg色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（精確到0.1 mg），用水充分溶解，定容至250 mL，貯存于4℃冰箱中保存，有效期1個(gè)月。

2.3.2 L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液

準(zhǔn)確移取色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、5.00 mL于10 mL容量瓶中，用水溶解至刻度，該標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、50μg/mL。

3實(shí)驗(yàn)過(guò)程

3.1試樣處理

稱取試樣0.2 g（精確到0.1 mg），置于50 mL離心管中，依次加入2 mLTris緩沖溶液、0.5 mL蛋白酶溶液、0.2 mL甲醇，置于旋渦混合器上混合至試樣全部溶解，并盡量減少試樣溶液掛壁。將混合后的試樣溶液置于50℃的恒溫培養(yǎng)箱中酶解16 h。同時(shí)做空白試驗(yàn)。將盛有水解液的離心管取出，冷卻至室溫，加入12 mL甲醇，全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度。取出約15 mL置于15 mL離心管中，以8 000 r/min～10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min～10 min，取離心后澄清液過(guò)0.22μm有機(jī)相尼龍濾膜，濾液備用。

3.2測(cè)定

分別移取2.00 mL試樣濾液及標(biāo)準(zhǔn)系列溶液置于10 mL比色管中，分別加入5.00 mL對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液，混勻，靜置20 min后加入0.2 mL亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置25 min。同時(shí)做試劑空白。

以試劑空白調(diào)零，在590 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以L-色氨酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1色氨酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3結(jié)果計(jì)算

試樣中色氨酸的含量按式（1）計(jì)算：

式中：

X為試樣中L-色氨酸的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣測(cè)定液中L-色氨酸的含量，單位為微克（μg）；C 0為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的空白試驗(yàn)測(cè)定液中L-色氨酸的含量，單位為微克（μg）；m為試樣質(zhì)量，單位為克（g）；V 1為試樣液定容體積（mL）；V 2為顯色時(shí)試樣液移取體積（mL）。

3.4酶解條件的確立

3.4.1正交試驗(yàn)

參照AOAC標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的酶解條件以及蛋白酶的反應(yīng)條件，設(shè)計(jì)了3因素（酶解時(shí)間、溫度，酶的用量）3水平的正交試驗(yàn)，酶解時(shí)間考察14、16、18 h3個(gè)水平；酶解溫度考察40、50、60℃3個(gè)水平；酶的用量考察250、500、1000μL 3個(gè)水平，結(jié)果詳見表1。結(jié)果表明，正交試驗(yàn)結(jié)果最滿意的為5號(hào)樣品，酶解條件為酶的用量為1000μL，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為16 h。

表1正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果，以1849a乳粉質(zhì)控樣（L-色氨酸含量為184±10 mg/100g）為實(shí)驗(yàn)樣品，確定最佳酶解時(shí)間、溫度和酶用量。

（1）酶解溫度

酶的用量設(shè)定為1000μL，時(shí)間設(shè)定為16 h，考察40、45、50、55、60℃等不同溫度下的測(cè)定結(jié)果，結(jié)果表明，當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí)，樣品達(dá)到酶解峰值，結(jié)果見圖2。

圖2在不同酶解溫度下的測(cè)定結(jié)果

（2）酶解時(shí)間

酶的用量設(shè)定為1000μL，溫度設(shè)定為50℃，分別考察不同酶解時(shí)間（14、16、18、20、22、24 h）的測(cè)定結(jié)果。試驗(yàn)表明，當(dāng)酶解的時(shí)間超過(guò)16 h以后，結(jié)果趨于穩(wěn)定，證明酶解充分。推薦的酶解時(shí)間為16 h，也可根據(jù)具體樣品調(diào)節(jié)酶解時(shí)間，結(jié)果見圖3。

圖3在不同酶解時(shí)間下的測(cè)定結(jié)果

（3）酶的用量

酶解時(shí)間設(shè)定為16 h，溫度設(shè)定為50℃，考察酶的用量對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果均為扣除試劑空白以后的結(jié)果。試驗(yàn)表明，當(dāng)酶的用量超過(guò)0.5 mL以后，結(jié)果趨于穩(wěn)定，說(shuō)明當(dāng)酶的用量為0.5 mL時(shí)，樣品基本酶解完全，綜合考慮到成本等問(wèn)題，建議采用0.5 mL的酶用量，結(jié)果見圖4。

圖4不同酶用量下的測(cè)定結(jié)果

3.5顯色條件的確定

3.5.1最大吸收波長(zhǎng)的確立

使用濃度為10、20、30、40、50μg/mL的L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照3.2進(jìn)行顯色處理，對(duì)樣液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

圖5不同濃度L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液全波長(zhǎng)掃描曲線

由5個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液的全波長(zhǎng)掃描結(jié)果可知，顯色液的最大吸收波長(zhǎng)確定為590 nm。

3.5.2硫酸溶液濃度的選擇

選取濃度為30μg/mL和75μg/mL的L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察硫酸溶液濃度變化對(duì)吸光度的影響。硫酸濃度分別為9、12、18、21.2 mol/L，吸光度隨硫酸溶液濃度增大而增大，并逐漸趨于穩(wěn)定，最終確定硫酸溶液濃度為21.2 mol/L測(cè)定結(jié)果最好，詳見圖6。

圖6硫酸溶液濃度對(duì)吸光度影響

3.5.3對(duì)二甲氨基苯甲醛濃度

選取濃度為30μg/mL和75μg/mL的L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他反應(yīng)條件不變，改變對(duì)二甲氨基苯甲醛濃度，考察其對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度的影響。吸光度先隨對(duì)二甲氨基苯甲醛濃度增大而增大，達(dá)到最高點(diǎn)后再緩慢下降。綜合考慮，選擇對(duì)二甲氨基苯甲醛的濃度為1%最合適，這與GB/T 15400-2018《飼料中色氨酸的測(cè)定》要求一致，見圖7。

圖7對(duì)二甲氨基苯甲醛濃度對(duì)吸光度影響

3.5.4亞硝酸鈉濃度

選取濃度為30μg/mL和75μg/mL的L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他反應(yīng)條件不變，改變對(duì)亞硝酸鈉濃度，考察其對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度的影響。總體上來(lái)說(shuō)，吸光度是隨亞硝酸鈉濃度增大而緩慢下降的。綜合考慮，認(rèn)為亞硝酸鈉濃度為0.2%最合適，這與GB/T 15400-2018《飼料中色氨酸的測(cè)定》要求一致，見圖8。

表2準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)表

圖8亞硝酸鈉濃度對(duì)吸光度影響

3.5.5反應(yīng)時(shí)間

顯色反應(yīng)涉及到兩步反應(yīng)，固定亞硝酸鈉反應(yīng)時(shí)間25 min，考察了30μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度隨對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)時(shí)間的變化。吸光度隨反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng)，先增大后趨于穩(wěn)定不變。因此選擇對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)時(shí)間為20 min，詳見圖9。

圖9對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度影響

固定對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)時(shí)間20 min，考察30μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度隨亞硝酸鈉反應(yīng)時(shí)間的變化。吸光度隨反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng)基本沒有變化。考慮到為使反應(yīng)充分和與GB/T 15400-1994一致，選擇亞硝酸鈉反應(yīng)時(shí)間為25 min，詳見圖10。

4準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)

4.1準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

對(duì)1849a質(zhì)控樣和全脂乳粉2個(gè)樣品，進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（n=6）,計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖10亞硝酸鈉反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度影響

L-色氨酸的回收率在97.3%～102.5%之間，質(zhì)控樣及全脂乳粉測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.32%～1.72%之間，方法的回收率好，準(zhǔn)確度高，完全能夠滿足實(shí)際樣品檢測(cè)的需求[13]。

4.2精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)1849a質(zhì)控樣、全脂乳粉和L-色氨酸營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化奶粉3種樣品進(jìn)行精密度（n=6）實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表3精密度實(shí)驗(yàn)表（n=6）

1849a質(zhì)控樣的測(cè)定結(jié)果為179.6～186.5 mg/100g，均在標(biāo)示的含量范圍內(nèi)（174～184 mg/100g），方法的準(zhǔn)確度高。3種樣品測(cè)定結(jié)果（n=6）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.2%～2.4%，說(shuō)明方法的精密度較好[14]。

5結(jié)論

本文參照AOAC標(biāo)準(zhǔn)的酶解前處理方法，建立了一種使用分光光度計(jì)測(cè)定乳粉中L-色氨酸的檢測(cè)方法。經(jīng)驗(yàn)證，在0.5μg/mL～50μg/mL濃度范圍內(nèi)，方法的線性關(guān)系良好。采用1849a質(zhì)控樣、全脂乳粉等進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)（n=6），方法的回收率分布在97.3%～102.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分布在0.32%～1.72%之間；樣品精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.2%～2.4%之間，方法的穩(wěn)定性好。