奶山羊CIDEa基因的克隆、序列分析與組織表達

李君，吳姣，權凱，候霞飛，楊芳慧，張景鋒，趙金艷，魏紅芳

(河南牧業經濟學院動物科技學院，河南省非常規飼料資源創新利用重點實驗室，河南 鄭州 450046)

羊奶的乳脂肪球較小，更易被消化吸收，同時羊乳中還含有比較豐富的短、中鏈脂肪酸、不飽和脂肪酸和共軛亞油酸對人類動脈硬化、冠心病、肝硬化等疾病有良好的預防保健作用[1]，這些短、中鏈脂肪酸是羊奶特殊的營養價值來源，并且羊奶風味品質與乳脂含量和組成之間密切相關。因此，研究乳脂代謝調控對于提高羊奶品質具有重要意義。

誘導細胞凋亡DNA片段化因子45樣效應因子A(cell death-inducing DNA fragmentation factor 45-like effectors, CIDEa)是一類和脂類代謝緊密相關的蛋白，屬于CIDE家族成員之一，在參與調控脂類代謝過程中具有十分重要的作用[2]。CIDEa在脂肪細胞和肝細胞中參與調控多個脂代謝通路，包括脂解、脂滴的生長融合和極低密度脂蛋白的成熟[3-4]。Zhou等[5]研究發現在肝臟細胞系及小鼠肝臟中過表達CIDEa能夠明顯的促進脂類的積累。在牛妊娠以及哺乳期，其乳腺組織中CIDEa基因的mRNA 水平高度表達[6]。Wang等[4]研究發現，CIDEa在雌性小鼠懷孕以及哺乳期的乳腺組織中高度表達，CIDEa缺失小鼠乳汁中脂類的含量明顯下降，導致新生小鼠不能正常發育。這些研究結果說明CIDEa在乳腺組織中參與調控脂質代謝，但是關于奶山羊CIDFEa在乳脂代謝方面的功能還不清楚。本研究旨在克隆奶山羊CIDEa基因編碼區序列，并進行生物信息學分析，檢測CIDEa基因在泌乳期和干奶期乳腺組織中的表達量，為初步探討CIDEa基因在奶山羊乳腺組織中的功能及對羊乳品質的調控作用提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

試驗動物來自河南西峽縣奶山羊場，選用體況良好，胎次相同，泌乳天數相近的河南奶山羊3只，分別采集泌乳前期(15 d)、盛期(90 d)、中期(120 d)和干奶期(330 d)的乳腺組織各1 g。用DEPC滅菌水反復清洗后，迅速放入已含有Trizol試劑的無RNase的離心管中，投入液氮中保存備用。

1.2 主要試劑

Trizol 購自美國Invitrogen公司，DEPC購自美國Sigma公司；DNA分子標準、DNA膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、pMD-19T載體、大腸桿菌(E.coli)TOP 10 感受態細胞均購自北京天根生化科技有限公司；T4 DNA 連接酶、DNA 限制性內切酶、反轉錄試劑盒PrimeScript?RT Reagent Kit、LA Taq DNA 聚合酶和實時定量試劑盒均購自寶生物工程大連有限公司(TaKaRa)。

1.3 引物設計

通過對GenBank中綿羊(XM_004020511)和牛(NM_001083449)等物種的CIDEa基因進行同源性比對，利用Primer Premier 5.0軟件在保守區域設計特異性克隆引物，上游引物序列：5′-GGACCGAGCGATGGAGAC-3′；下游引物序列：5′-AGCAGGTGATGCTGGTGGGAAC-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 RNA提取與cDNA的合成

采用Trizol一步法提取羊乳腺組織總RNA，具體操作步驟按照說明書操作進行。按照TaKaRa公司PrimeScript?RT reagent Kit說明書進行操作，將檢測合格的RNA反轉錄成cDNA。

1.5 PCR擴增

對CIDEa基因進行PCR擴增，反應條件為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行34個循環；最后72 ℃再延伸10 min，12 ℃進行保存。反應結束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將檢測正確的目的片段進行瓊脂糖凝膠回收，PCR回收產物與pMD19-T載體進行連接，連接產物轉化Top10感受態細胞。37 ℃培養箱中培養12～16 h，進行藍白斑篩選，挑取多個白色菌落擴繁提取質粒，經酶切鑒定為陽性的質粒進行測序。

1.6 生物信息學分析

奶山羊CIDEa與不同物種間序列比對方法及蛋白質結構預測參照文獻[7-8]。利用NCBI中的Blastn和Blastp(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 對測序得到的CIDEa基因與其他物種的核苷酸及其編碼的氨基酸序列進行同源性分析；通過BioXM2.6軟件對CIDEa的核苷酸序列進行多物種間序列比對；利用ProtParm在線程序(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)對奶山羊CIDEa蛋白利用SignalP在線程序進行理化參數分析；用TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線預測CIDEa的跨膜結構；利用ProScale在線程序(http://web.expasy.org/protscale/)對CIDEa基因的蛋白質疏水性進行分析；利用PSPRTⅡ Prediction在線網站(http://psort.hgc.jp/form2.html)預測蛋白質的亞細胞定位；利用Phyre2(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)對CIDEa基因的蛋白質三級結構進行預測分析。

1.7 熒光定量PCR

試驗以GAPDH為內參基因，每個模板設置三個加樣重復，PCR反應體系：2×SYBR Premix Ex Taq Mix 10.0 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物 (10 μmol/L) 各0.8 μL，加RNase free H2O補足20 μL體系。于ABI 7500熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環；添加熔解曲線。采用2-ΔΔCt法對數據進行分析，其中兩個內參基因Ct值取幾何平均數，然后按照ΔCt=Ct目的基因-Ct內參；ΔΔCt=ΔCt試驗組-ΔCt對照組計算分析。所用到的基因實時定量引物如表1。

表1 實時定量PCR引物序列

1.8 數據統計分析

數據采用“平均值±標準差”進行分析，利用SPSS22.0方差檢驗進行數據統計分析，P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 奶山羊CIDEa基因PCR擴增與序列分析

如圖1所示，從奶山羊乳腺組織組織中擴增得到大小為764 bp的片段。序列分析發現，該基因編碼區序列為660 bp，編碼219個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker;1.奶山羊CIDEa基因PCR擴增產物

圖2 奶山羊CIDEa基因編碼區核苷酸序列和預測氨基酸序列

2.2 奶山羊CIDEa基因的同源性分析

奶山羊CIDEa基因的序列分別與GenBank中綿羊(XM_004020511)、牛(NM_001083449)、豬(NM_001112696)和人(NM_001279)等物種的CIDEa基因序列進行比對，結果表明，奶山羊CIDEa基因編碼區核苷酸序列與綿羊、牛、豬和人等物種的的同源性分別為99%、96%、85%、85%；與綿羊(XP_004020560.1)、牛(NP_001076918.1)、豬(NP_001106166.1)和人(NP_001270.1)等物種的CIDEa編碼氨基酸序列的同源性為99%、96%、84%和80%。

2.3 奶山羊CIDEa蛋白理化性質及一級結構分析

對奶山羊CIDEa基因CDS編碼氨基酸序列的理化性質預測結果顯示，其蛋白質分子量為24.408 kD，理論等電PI為9.27，屬于堿性蛋白；總原子數為3441，分子式為C1077H1732N306O312S14；消光系數為18700；帶負電荷的天冬氨酸和谷氨酰胺這兩個氨基酸殘基共有20個，帶正電荷的精氨酸和賴氨酸這兩個氨基酸殘基共有26個；編碼氨基酸的不穩定性指數為58.89，說明該蛋白為不穩定蛋白；體外蛋白半衰期為30 h；脂溶指數為84.11，說明該蛋白的流動性較好；蛋白疏水性分析發現(圖3)，最大值為1.789，最小值為-2.9，分別位于第69位脯氨酸和第44 位精氨酸處，平均親水性為-0.169，整個蛋白表現出高度的親水性。

圖3 CIDEa蛋白疏水性分析

對CIDEa編碼的氨基酸組成進行分析發現，該蛋白由20種氨基酸組成(表2)，其中亮氨酸、蘇氨酸和纈氨酸、精氨酸和絲氨酸含量較高，分別占11.9%、8.2%、7.3%；色氨酸的含量最低，只占1.0%；不含吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸。

表2 奶山羊CIDEa蛋白的氨基酸組成

氨基酸名稱縮寫數量(個)比率(%)丙氨酸A156.8精氨酸R167.3天冬氨酰N31.4天冬氨酸D94.1半胱氨酸C41.8谷氨酰胺Q104.6谷氨酸E115.0甘氨酸G156.8組氨酸H73.2異亮氨酸I41.8亮氨酸L2611.9賴氨酸K104.6甲硫氨酸M104.6苯丙氨酸F83.7脯氨酸P125.5絲氨酸S167.3蘇氨酸T188.2色氨酸W20.9酪氨酸Y52.3纈氨酸V188.2吡咯賴氨酸O00.0硒半胱氨酸U00.0

2.4 奶山羊CIDEa蛋白信號肽與跨膜結構預測

采用TMHMM和SignalP 4.1在線軟件對奶山羊CIDEa蛋白進行跨膜結構分析和信號肽分析(圖4,5)，該蛋白不存在跨膜域及信號肽，故此蛋白不屬于跨膜蛋白及分泌蛋白。

圖4 CIDEa蛋白跨膜結構預測

圖5 CIDEa蛋白信號肽預測

2.5 奶山羊CIDEa蛋白亞細胞定位預測

采用PSPRTⅡ Prediction在線軟件預測奶山羊CIDEa蛋白亞細胞定位，結果表明，其蛋白定位于細胞質、線粒體、細胞核、液泡和內質網的比例分別為47.8%、26.1%、17.4%、4.3%和4.3%，說明CIDEa蛋白主要分布于細胞質。

2.6 奶山羊CIDEa蛋白三級結構預測

利用Phyre2在線預測得到奶山羊CIDEa蛋白質三級結構(圖6)，CIDEa蛋白結構主要由2個α-螺旋和4個β-折疊組成，此外還有部分的無規則卷曲。

圖6 奶山羊CIDEa蛋白三級結構預測

2.7 奶山羊CIDEa泌乳期和干奶期乳腺組織表達分析

以GAPDH為內參基因，通過實時熒光定量PCR技術檢測奶山羊CIDEa基因在不同泌乳時期乳腺組織的mRNA表達量。結果表明，CIDEa基因在泌乳前期、盛期和中期的mRNA表達量均顯著高于干奶期(P<0.05)(圖7)，然而，CIDEa基因在泌乳前期、盛期和中期的表達量沒有顯著差異(P>0.05)。

圖7CIDEa基因在奶山羊不同泌乳時期乳腺組織中的相對表達量

3 討論

CIDEa基因屬于細胞死亡誘導因子a家族，最初報道它的功能與caspase依賴的細胞凋亡以及DNA斷裂有關。近年來關于CIDEa蛋白的研究主要集中在脂代謝方面。CIDE家族共有三個蛋白分別是CIDEa、CIDEb和CIDEc。CIDEa和CIDEc主要在脂肪組織的脂類穩態調控中發揮重要作用，而CIDEb主要在肝臟中發揮作用。CIDEa蛋白可促進野生型小鼠體內的脂肪沉積[9]，敲除CIDEa基因的小鼠，脂肪分解速度加快，大脂滴減少而小脂滴增加，體內脂肪積累減少，體重減輕[10]。Wang等[4]研究表明CIDEa調控小鼠乳脂滴的大小和分泌。在牛的泌乳期乳腺組織中CIDEa表達顯著高于干奶期和非妊娠期，并且胰島素和飽和脂肪酸可調控CIDEa的表達[6]。說明CIDEa基因參與乳腺的脂質代謝過程。本試驗為研究CIDEa基因在奶山羊乳腺中的功能，根據已發表的綿羊CIDEa基因序列設計引物，采用PCR方法擴增得到奶山羊CIDEa基因的完整編碼區序列，發現奶山羊CIDEa基因開放閱讀框長660 bp，可編碼219個氨基酸，奶山羊CIDEa基因的成功克隆，為進一步研究CIDEa基因在奶山羊乳脂代謝方面的功能提供依據。

利用生物信息學軟件分析基因及其編碼蛋白的結構與功能，能為進一步研究基因功能做導向。在本研究中，通過生物信息學軟件預測發現奶山羊CIDEa蛋白是一個不穩定的堿性蛋白，通過疏水性分析和理化參數分析得到CIDEa蛋白是親水性蛋白。不同物種間CIDEa基因及其編碼序列比對發現，奶山羊與牛和綿羊之間同源性較高，與人和豬同源性較低。提示在反芻動物中CIDEa基因進化比較保守，但其蛋白功能是否存在差異還需要進一步的研究。本研究發現，奶山羊CIDEa蛋白不屬于跨膜蛋白和分泌蛋白。亞細胞定位表明，奶山羊CIDEa蛋白主要分布在細胞質、線粒體上和細胞核上，少部分分布在液泡和內質網上。前人研究表明，CIDEa蛋白定位于脂滴表面及內質網上[11,12]和細胞核內[4]，可促進小鼠體內的脂肪擴張與沉積[9]，有研究表明 CIDEa 蛋白C端104個氨基酸對其脂滴定位非常重要[13]。Zhou等[14]研究發現CIDEa與線粒體特異的標志蛋白Ucp1共定位，說明CIDEa定位于線粒體上，并且通過與UCP1直接或間接相互作用形成一個復合體，參與能量代謝。本研究中對奶山羊CIDEa蛋白的亞細胞定位結果預測與前人研究結果一致，對奶山羊CIDEa蛋白進行生物學預測和分析，為深入研究奶山羊CIDEa基因的功能提供理論依據。

CIDEa在多種組織中廣泛表達，在小腸、肝臟、脾臟、淋巴結、腎臟等組織中均有表達，其中在脂肪組織中表達最高[15-16]。Li等[16]研究發現CIDEa在豬脂肪組織中高量表達、在淋巴組織中大量表達；另外，CIDEa在脾、肺、腎、肝、腦和胃中較多量表達，在小腸、肌肉和心臟中微量表達。黃柳梅[15]報道CIDEa基因在肉雞的各組織中廣泛表達，且表達豐度相差較大，在脂肪組織中的表達量最高。CIDEa在小鼠妊娠以及哺乳期的乳腺組織中高度表達[4]，在牛的泌乳期乳腺組織中CIDEa表達明顯高于干奶期和非妊娠期[6]。本研究通過實時熒光定量PCR檢測CIDEa在奶山羊不同泌乳時期乳腺組織中的mRNA表達量，結果表明奶山羊CIDEa基因在泌乳期乳腺組織中的表達量均顯著高于干奶期。本試驗結果與前人研究結果相符。這些結果表明CIDEa基因可能參與調控乳腺組織中的乳脂代謝。研究報道CIDEa受到轉錄水平的調節，CIDEa的啟動子含有PPARα和PPARγ的應答元件，能夠被PPARs的激動劑激活[17]。PGC1α能夠激活CIDEa的轉錄，而RIP140能夠抑制這一過程[18]。而PPARγ和SREBP1c是經證實的參與奶山羊乳脂代謝調控的關鍵轉錄因子，關于CIDEa基因在奶山羊乳腺組織中的功能及對乳脂代謝的調控機制還需要進一步的深入研究。

4 結論

本試驗成功克隆奶山羊CIDEa基因CDS區660 bp的序列，編碼219個氨基酸；生物信息學分析表明，該編碼序列與綿羊、牛、豬和人的核苷酸同源性分別為99%、96%、85%和85%；CIDEa蛋白屬于堿性、不穩定、親水蛋白質，主要分布在細胞質、線粒體和細胞核，不存在跨膜結構和信號肽；CIDEa基因在奶山羊泌乳期(前期、盛期和中期)的乳腺組織中表達量顯著高于干奶期，表明CIDEa基因可能參與奶山羊乳脂代謝過程，為進一步改善羊奶品質提供理論依據。