青海牦牛卵巢顆粒細胞體外培養及kisspeptin-10對其孕酮分泌的影響和機制研究

2020-03-23 10:48:12張琳欽張君徐尚榮彭巍舒適關凱文趙明旺

畜牧與獸醫 2020年3期

關鍵詞：差異

張琳欽，張君，徐尚榮，彭巍，黃榮，舒適，關凱文，趙明旺

(1. 青海大學農牧學院，青海西寧 810016；2. 青海大學畜牧獸醫科學院，青海西寧 810016)

中國是飼養牦牛數量最多的國家，牦牛的養殖大多分布于青藏高原，其在高寒牧區具有不可替代的生態、社會、經濟地位[1]。但處于青藏高原嚴酷的環境下，牦牛的生產性能低下，繁殖性能低下尤其明顯[2]。而在動物生殖發育進程中，卵巢顆粒細胞一直起著不容忽視的作用。研究牦牛卵巢顆粒細胞，對更好地理解牦牛的生殖機理及進一步提高牦牛繁殖力具有重要的理論價值和現實意義。

近年來，對哺乳動物卵巢顆粒細胞體外培養體系的研究和建立已較為成熟[3]。因此，在借鑒前人研究的基礎上，對青海牦牛卵巢顆粒細胞進行體外分離和培養，建立完善的培養體系是十分必要的，顆粒細胞也確實是研究動物卵巢內分泌功能及生殖生理學的一種理想細胞模型[4]。

孕酮(progesterone, P4)在卵泡排卵和黃體形成過程中發揮作用，能促進子宮機能的成熟，適量的孕酮更有助于雌性動物維持正常性欲和生殖功能[5]。而顆粒細胞的增殖與分化能夠直接影響孕酮的分泌，作為卵泡內包裹卵子的細胞群體，它還能夠影響卵泡的發育、排卵、黃體形成過程及類固醇激素[6]。也有研究證實，體外培養的顆粒細胞可以自發的分泌孕酮和雌激素，而不需要雄激素作為合成底物[7-8]。

目前，在對生殖啟動的關鍵因子Kisspeptin的研究中發現，它的最小活性片段，具有高度物種間保守性的Kisspeptin-10(kp-10)，對顆粒細胞的增殖和孕酮的分泌具有促進作用[9-12]。然而kp-10在牦牛上是否同樣對卵巢顆粒細胞孕酮分泌有調節作用尚不清楚。

本研究分離和培養青海牦牛卵巢顆粒細胞，并在此基礎上探討kp-10對青海牦牛卵巢顆粒細胞孕酮分泌的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

從青海西寧裕泰屠宰場采集剛屠宰的牦牛卵巢，挑選外觀色澤光亮、發育正常、沒有黃體、有腔卵泡多而飽滿的卵巢，放入裝有37 ℃含雙抗的生理鹽水恒溫保溫杯中，于4 h內運回實驗室。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12培養液(GIBCO)、胎牛血清(GIBCO)、青鏈霉素混合液(BOSTER)、胰酶(BI)、ITS(Sigma)、Kisspeptin蛋白劑(millipore)、PBS(TRANS)、孕酮試劑盒(Bovine P)、Hoechst33258(Solarbio)、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L), PE conjugate(TRANS)、FSHR兔多克隆抗體(BOSTER)、即用型正常山羊血清(BOSTER)、Triton-X-100(Solarbio)、Trypan Blue(Solarbio)、4%多聚甲醛(Solarbio)、Fluo-4 AM(Beyotime)。

1.2 方法

1.2.1 青海牦牛卵巢顆粒細胞的分離和培養

在實驗室無菌環境下，使用預熱的37 ℃生理鹽水再次清洗采集回的卵巢，并修剪掉采集卵巢時未除掉的多余韌帶、系膜等結締組織。生理鹽水清洗卵巢3次，然后在超凈臺內，使用5 mL注射器抽吸卵巢上2～8 mm卵泡內的卵泡液，并集中收集入15 mL無菌離心管中。使用100 μm細胞篩過濾卵泡液以去除卵母細胞，常溫下，離心(1 000 r/min，5 min)。棄上清，加入含1%雙抗的PBS，吹打混勻并清洗細胞3次。離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，加入2 mL含胎牛血清的完全培養基，制成單細胞懸液。取100 μL單細胞懸液，再加入等量的臺盼藍染液，進行染色和計數。將細胞懸液調整濃度至4×105/mL接種于25 mL的細胞培養瓶中，于5%CO2、95%空氣、37 ℃條件下，飽和濕度的培養箱中培養，24 h后換液1次。期間，PBS沖洗，去除未貼壁細胞和雜質。之后，每48 h換液1次。

1.2.2 FSHR表達鑒定牦牛卵巢顆粒細胞

胰酶消化原代細胞，制備單細胞懸液，將4×105/mL的細胞懸液注入放有8 mm圓形載玻片的35 mm細胞培養皿中，在5% CO2、95%空氣、37 ℃條件下，飽和濕度的培養箱中培養24 h，細胞長至貼壁面80%，取出細胞爬片，用PBS沖洗1 min×3次，4%多聚甲醛固定20 min后，進行細胞免疫化學染色：固定好的細胞爬片，PBS洗滌1 min×3次；0.4% Triton通透細胞膜10 min，PBS洗滌1 min×3次；即用型正常山羊血清封閉30 min,除液，不用PBS洗滌；加入一抗FSHR兔多克隆抗體(1∶100)，4 ℃孵育，過夜；取出細胞爬片，PBS洗滌1 min×3次，加入二抗羊抗兔IgG(H+L)(1∶100)，室溫，避光1h，PBS洗滌1 min××3次，加入1 mg/L的Hoechst33258，室溫5 min。PBS代替一抗，陰性對照。熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 卵巢顆粒細胞HE染色

顆粒細胞培養過程中，分別于6、12、18、24、36、48、72及96 h取出提前放置的細胞爬片，用PBS沖洗1 min×3次，4%多聚甲醛固定20 min，再用PBS沖洗2次后，蘇木素染色2 min，流水沖去浮色，入鹽酸酒精中分色數秒，流水沖洗2 min，鏡下細胞核染色清晰，胞漿不著色。5%伊紅染色2 min，流水沖去浮色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片后，光鏡下觀察細胞形態。

1.2.4 CCK法檢測牦牛卵巢顆粒細胞的活力

取顆粒細胞，以6×104/mL接種于96孔板，每孔加入完全培養基(含FBS)100 μL，在5%CO2、95%空氣、37 ℃條件下，飽和濕度的培養箱中培養。每次選取3個復孔，于6、12、18、24、36、48、72及96 h加入CCK，避光培養2 h后，使用酶標儀，測定450 nm的細胞OD值。以含培養基和CCK的無細胞處理組為空白對照。

1.2.5 不同處理時間及不同濃度下kp-10對牦牛卵巢顆粒細胞活性的影響

取顆粒細胞，按6×104/mL接種于96孔板，每孔加入完全培養基(含FBS)100 μL，在5% CO2、95%空氣、37 ℃條件下，飽和濕度的培養箱中培養6 h。細胞貼壁完全，每孔再加入等量的1% ITS培養基(即無血清培養基)，繼續培養6 h。換無血清培養基穩定培養12 h，棄原液。加入含有不同濃度kp-10(0、10、100及1 000 nmol/L)的無血清培養基繼續培養細胞；分別于給藥后12、24、48及72 h加入含CCK的培養基，避光培養2 h。使用酶標儀，測定450 nm的細胞OD值。期間，收集適量24 h批次未加CCK的細胞上清，放于-20 ℃凍存，用于孕酮含量檢測。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞內Ca2+濃度

方法同1.2.5，加入不同濃度的kp-10、Verapamil單獨或共同處理細胞24 h后， ELLSA測上清內孕酮含量。細胞則通過胰酶消化后，收集并用PBS(無鈣)清洗3遍。加入Fluo-4 AM工作液，室溫孵育60 min。PBS(無鈣)清洗3遍，室溫孵育20 min。最后用PBS(無鈣)制備單細胞懸液，調整濃度至1×106/mL。于流式細胞儀上檢測，獲取的熒光值，通過流式細胞儀自帶的Cyt Expert軟件分析處理。

1.2.7 ELLSA法檢測孕酮含量

收集各組待測的細胞上清，孕酮水平通過ELLSA法進行測定。測定方法按牛孕酮(P)酶聯免疫分析試劑盒說明書進行。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，得出回歸曲線Y=0.109X-0.000 837，相關系數R2=0.996。通過標準曲線計算樣品中牛孕酮(P)濃度。

1.3 統計方法

采用SPSS 23.0、Graphpad Prism5對數據進行統計分析并作圖。每個處理組設3個重復，每個試驗重復3次，測定結果以x±s表示，細胞活力OD值及孕酮濃度用單因變量多因素方差分析、多重比較LSD檢驗進行兩兩比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 分離培養細胞的FSHR鑒定

圖1所示，細胞培養24 h后(圖A)，對其進行 FSHR免疫熒光染色。倒置熒光顯微鏡觀察：細胞核被Hoechst333258染成藍色(圖B)，分離、培養的細胞基本都表達FSHR(圖C)，疊加后發現FSHR陽性細胞與核染完全重合(圖D)，鏡下計數顯示，表達FSHR陽性細胞>97%，分離培養的細胞確實為牦牛卵巢顆粒細胞。

A.光鏡下培養24 h的細胞；B.Hoechst33258細胞核染色；C.細胞的FSHR染色；D.FSHR和Hoechst33258合并圖

2.2 牦牛卵巢顆粒細胞形態觀察

由圖2可知，牦牛卵巢顆粒細胞在6 h內就能貼壁，并在貼壁初期，部分集中聚集生長，細胞在增殖過程中由密集向稀疏部位遷移，至布滿貼壁面，細胞形態由梭形、多邊形呈放射狀至鋪路板狀再慢慢變為呈纖維狀。

A.培養6 h顆粒細胞；B.培養12 h顆粒細胞；C.培養18 h顆粒細胞；D.培養24 h顆粒細胞；E.培養36 h顆粒細胞；F.培養48 h顆粒細胞；G.培養72 h顆粒細胞；H.培養96 h顆粒細胞

圖2 牦牛卵巢顆粒細胞HE染色(×100)

2.3 牦牛卵巢顆粒細胞生長活力檢測

CCK是根據檢測細胞的還原結果來反映細胞的活力和增殖情況。分別于6、12、18、24、36、48、72及96 h檢測細胞活力。結果(圖3)可見，細胞生長曲線呈“S”型，在24 h內處于潛伏期，6 h至12 h至18 h差異皆不顯著(0.11±0.01vs0.11±0.01vs0.11±0.01,P>0.05)。培養24 h至72 h，細胞進入對數生長期，18 h至24 h至36 h至48 h至72 h差異皆顯著(0.11±0.01vs0.15±0.02vs0.35±0.01vs0.46±0.03vs0.61±0.01,P<0.05),72 h至96 h差異不顯著(0.61±0.01vs0.62±0.01,P>0.05)，根據測得OD值結果，推斷細胞已長滿細胞培養孔，進入平臺期。以上結果表明，牦牛卵巢顆粒細胞符合貼壁細胞的生長規律，細胞培養狀態良好[13]。

2.4 不同處理時間及不同濃度的Kisspeptin-10對牦牛卵巢顆粒細胞活力的影響

圖4顯示，10和100 nmol·L-1kp-10處理12 h均顯著提高顆粒細胞的活力(0.64±0.02vs0.58±0.03，0.69±0.02vs0.58±0.03，P<0.05)，1 000 nmol·L-1kp-10處理12 h，細胞活力被顯著抑制(0.51±0.03vs0.58±0.03，P<0.05)；10、100和1 000 nmol·L-1kp-10處理24 h、48 h、72 h均顯著提高顆粒細胞的活力，100 nmol·L-1kp-10效果最佳(24 h:0.77±0.02vs0.59±0.01, 0.85±0.01vs0.59±0.01,0.74±0.03vs0.59±0.01;48 h:0.92±0.01vs0.62±0.01, 1.28±0.03vs0.62±0.01, 1.05±0.06vs0.62±0.01; 72 h: 1.5±0.01vs0.66±0.01, 1.6±0.01vs0.66±0.01, 1.56±0.01vs0.66±0.01，P<0.05)。