白羽肉雞血管緊張素轉換酶2(ACE2)全基因克隆及序列信息分析

紀曉霞，李帥，許濛，楊博，張源淑

(南京農業大學農業部動物生理生化重點開放實驗室，江蘇 南京 210095)

血管緊張素轉換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)是2000年首次報道的一種單羧肽酶，它由一個信號肽、一個跨膜區及鋅結合區位點三部分組成[1]。ACE2將血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)降解為具有舒張血管及抗增殖作用血管緊張素(1-7)[Ang(1-7)]，也可將血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)降解為Ang(1-9)。Ang(1-7)通過其受體Mas(MasR)發揮抗氧化、抗纖維化、抗炎等作用[2-4]。目前ACE2的研究主要集中在糖尿病、高血壓、腎病等方面的研究[5-6]。已成為人醫臨床研究的一個熱點和前沿領域，但是對于動物，特別是家禽方面的研究尚沒有文獻報道。

本研究擬以白羽肉雞為研究對象，應用RT-PCR和基因克隆技術擴增并鑒定白羽肉雞ACE2基因序列片段，利用生物信息學方法，進行不同物種ACE2基因系統發育分析，對白羽肉雞ACE2基因序列蛋白質的理化性質、二級結構及親水性、蛋白質跨膜結構和信號肽預測、亞細胞定位和蛋白質磷酸化、糖基化、三級結構等進行分析，旨在為白羽肉雞ACE2基因結構與功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

21日齡白羽肉雞，購自陸氏養殖場，頸部放血處死后取心臟、肝臟、肺臟、腎臟、回腸、盲腸、空腸等組織，經生理鹽水漂洗后放入液氮，移至-70 ℃保存。

1.2 主要儀器和試劑

BamHⅠ、HindⅢ限制性內切酶購自武漢ABclonal公司；質粒小提試劑盒購自美國Omega公司；Trans Start Fast Pfu DNAPolymerse購自南京全式金公司；Trizol試劑盒、感受態細胞、反轉錄試劑盒購自南京諾唯贊公司；PremixTaq酶、pMD-19T載體購自日本TaKaRa公司，DNA凝膠回收試劑盒購自南京AxyGen公司。

Nandrop2000核酸蛋白分析儀(Eppendorf，德國)，Tone PCR擴增儀(Biometa，美國)，Tanon-5200Multi全自動化學發光圖像分析系統(上海天能科技有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1 白羽肉雞各種組織中ACE2基因和蛋白的表達檢測

1)組織總RNA提取及反轉錄產物合成

隨機取約100 mg上述白羽肉雞各組織，徹底勻漿后參照Trizol Reagent操作步驟分別提取白羽肉雞組織總RNA，利用Nandrop2000核酸蛋白分析儀測定RNA的濃度和純度，選取OD260/OD280比值為1.8-2.0的樣品采用二步法反轉錄，反轉錄具體步驟按照反轉錄酶試劑盒說明書進行。-20 ℃保存cDNA。

2)引物設計

內標基因18SrRNA選用Ambion Universal18S internal standard, 產物長度315 bp。根據GenBank中預測的雞ACE2基因序列(XM-416822.5)設計。ACE2及內標基因18S rRNA引物根據GenBank序列，用Primer Premier 5軟件設計上、下游引物序列，引物參數指標見表1，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 目的基因及內標引物序列

3)白羽肉雞ACE2部分基因及內標基因18S rRNA克隆

將RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系(25 μL)。反應條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性20 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min 15 s，72 ℃徹底延伸5 min，32個循環。PCR反應結束后取10 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 白羽肉雞ACE2全基因克隆

1)組織總RNA提取及反轉錄產物合成

同1.3.1

2)引物設計

引物設計根據GenBank中的預測的雞ACE2基因序列(XM-416822.5)設計，上下游引物分別插入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(標注下劃線)，引物參數指標見表2，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

3)全基因PCR擴增

將RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系：cDNA模板2 μL，反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min 15 s，40個循環；72 ℃ 10 min。PCR反應結束后取10 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 白羽肉雞ACE2全基因的引物序列

基因引物方向引物序列(5′-3′)產物大小/bpACE2上游引物CGGGATCCATGTTGCTTCACTTCTGGCTTCTCTGTG下游引物GCGAAGCTTCTAAAAGGATGTTTGTGTCTCTTCAGATTGCTCA2 444

4)PCR產物的克隆及序列測定

利用DNA膠回收試劑盒純化回收PCR產物，具體步驟參照DNA膠回收試劑盒試劑盒說明書進行。回收產物和pMD19T載體進行連接(16 ℃，14 h)，將連接產物轉化至感受態細胞DH5α中。將菌體重懸涂布在LB/Amp/X-Gal/IPTG培養基平板上，37 ℃培養16 h。挑取培養皿上的單克隆接種于含有氨芐的液體培養基中，培養過夜。

利用質粒小型提取試劑盒提取質粒，提取的質粒用HindⅢ單酶切及BamHⅠ、HindⅢ雙酶切進行驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳。將鑒定的陽性質粒送上海英俊生物技術有限公司測序。

5)生物信息學分析

使用NCBI網站中的(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)查找開放閱讀框功能，利用Bio Edit Sequence Alignment Editor對核苷酸序列和與之對應的氨基酸序列進行Fas格式轉換，利用NCBI網站Blast軟件進行核苷酸的同源性比對分析，運用DNAStar軟件中MegAlign模塊，將克隆的雞ACE2氨基酸序列與GenBank上收錄的其他動物的氨基酸的序列進行同源性分析。利用MegAlign軟件繪制遺傳進化樹進行親緣性分析。利用在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)以及DNA Star里的Protean分析蛋白質理化性質，利用DNAStar程序包里Protean軟件分析親水性。利用TMHMM在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行蛋白質跨膜結構分析，利用SignalP在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP-4.0/)進行蛋白質信號肽分析，利用NetPhos2.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對ACE2基因編碼蛋白質進行磷酸化、糖基化位點預測，利用Phyre2.0軟件預測蛋白質的三級結構

2 結果與分析

2.1 白羽肉雞不同組織中ACE2分布

ACE2在白羽肉雞各組織中的基因表達。取白羽肉雞組織反轉錄產物進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1顯示。在白羽肉雞腎臟、十二指腸、回腸、盲腸、空腸組織均有單一條帶，條帶大小為395 bp左右，與預期大小一致。

M.DNAMaker；1. 18S rRNA基因；2.陰性對照；3.十二指腸；4.肝臟；5.盲腸；6.心臟；7.腎臟；8.回腸；9.空腸；10.肌胃；11.肺臟；12.胰臟

圖1 白羽肉雞各組織中ACE2基因表達

2.2 白羽肉雞ACE2全基因擴增

取白羽肉雞空腸組織反轉錄產物進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果有單一條帶出現，與預期(2 444 bp)大小一致。

M. DNA Maker；1～4.白羽肉雞空腸；5.陰性對照；6. 18S rRNA基因

圖2 ACE2全基因PCR擴增產物

2.3 白羽肉雞ACE2基因克隆結果

對目的片段進行回收后連接到pMD-19T，連接產物轉入至DH5α感受態細胞，再涂布到含Amp/IPTG/X-gal的LB平板上，形成了單克隆菌落。挑選2個陽性菌落進行PCR驗證，結果在2 000-3 000 bp之間有單一條帶(圖3)。PCR鑒定插入載體的片段大小與PCR擴增片段一致。提示陽性菌落中目的片段插入成功。

M. DNA Maker;1～2. pMD-19T-ACE2-陽性菌落;3. 陰性對照

圖3 菌液PCR擴增ACE2基因

酶切驗證結果如圖4所示。HindⅢ單酶切后發現有1條5 136 bp左右的條帶，大小與pMD-19T載體(2 692 bp)和目的基因(2 444 bp)總和一致；BamHⅠ、HindⅢ雙酶切可見2 444 bp和2 692 bp左右兩條帶。此結果證實已成功構建pMD-19T-ACE2重組載體。

M. DNA Maker;1、4. pMD-19T-ACE2重組質粒;2、5. pMD-19T-ACE2重組質粒單酶切;3、6. pMD-19T-ACE2重組質粒雙酶切

圖4 pMD-19T-ACE2重組質粒酶切鑒定

2.4 白羽肉雞ACE2基因的測序

利用Sanger測序法對陽性質粒進行正反兩個方向的序列測定，測序由上海英俊生物技術有限公司進行。測序結果表明本試驗所克隆白羽肉雞ACE2基因全長核苷酸序列為2 444 bp，與預期結果大小一致，表明克隆成功。測序結果已登錄GenBank，登錄號為MK560199。

2.5 白羽肉雞ACE2基因的生物信息學分析

2.5.1 開放閱讀框分析

通過ORF Finder分析表明，該ACE2基因ORF長度為2 427 bp，編碼808個氨基酸。與GenBank上提供的人、褐家鼠(805個氨基酸)的ACE2氨基酸相差3個，與牛、羊(804個氨基酸)相差4個氨基酸。

進一步對ACE2基因編碼蛋白質的氨基酸組成分析，結果發現白羽肉雞ACE2基因編碼的蛋白質含有20種氨基酸 (圖5)，其中Leu (8.3%) 含量最高，其次Glu (7.9%)、Ala (7.8%)含量較高，Cys (1.2%)較少。

圖5 白羽肉雞ACE2基因編碼蛋白質氨基酸組成

2.5.2 序列同源性分析

ACE2基因序列比對結果如表3。

表3 白羽肉雞ACE2基因同源性分析結果

物種GenBank登錄號同源性/%雞(Partial Gallusgallus)GQ262780.199紅原雞(Prediction Gallusgallus)XM-416822.599中華田園犬(Canislupusfamiliaris)NM-001165260.169中國獼猴(Macacamulatta)FJ170098.169薩能奶山羊(Caprahircus)NM-001290107.168家貓(Feliscatus)NM-001039456.168京都種大鼠(Rattusnorvegicus)NM-001012006.168斑馬魚(Daniorerio)NM-001007297.156人(Homosapiens)NM-021804.250

本試驗選用白羽肉雞基因序列與GenBank上已有的雞的ACE2部分序列和預測序列同源性都為99%。與薩能奶山羊、家貓、中華田園犬、中國獼猴、人、斑馬魚和京都種大鼠的同源性分別在51%～69%，與人的同源性最低為50%。

2.5.3 氨基酸序列同源性分析及分子進化分析

運用DNAStar軟件中MegAlign模塊，將克隆的白羽肉雞ACE2氨基酸序列與GenBank上收錄的其他動物的氨基酸的序列進行同源性分析。氨基酸序列比對結果如圖6，其與GenBank上收錄及預測的2個雞的序列同源性分別是99.9%和98.8%。與牛、山羊、家貓、家犬、兔、獼猴、人、斑馬魚和褐家鼠的同源性分別在59%～67%，與牛、山羊的同源性最低，為7.5%和8.3%。

利用MegAlign軟件繪制遺傳進化樹進行親緣性分析。結果如圖7顯示，該片段與家豬氨基酸序列處于同一進化群中，與牛和山羊處于完全不同的兩個分支中，與氨基酸進化結果一致。

圖6 白羽肉雞ACE2氨基酸同源性分析

圖7 白羽肉雞ACE2基因序列分子進化分析

2.6 白羽肉雞ACE2基因編碼蛋白質結構分析

2.6.1 編碼蛋白質理化性質分析

白羽肉雞ACE2基因編碼蛋白質由808個氨基酸殘基組成，其分子式為C4169H6339N1101O1242S37，分子量為92 942.05，理論pI 為5.17，說明該蛋白質為酸性蛋白質。預測該蛋白不穩定系數為40.48，大于40，為不穩定蛋白質。帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu=109)大于帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys=81)，其摩爾消光系數為185 235 L/(mol·cm)，1A(280)=1.993mg/mL，pH為7時，帶電量為5.166，親水性的平均值為-0.417，比值為負值，推測該ACE2為親水性蛋白質。

2.6.2 白羽肉雞ACE2蛋白親水性/疏水性分析

利用在線軟件進行白羽肉雞ACE2蛋白親水性/疏水性分析，結果顯示該蛋白質存在較多的親水性區域，較少的疏水性區域，但其中親水性較高的區域主要集中在Met1-Gln18和Thr740-Thr763，疏水性較高的區域主要集中在Ile155-Tyr251和Gly764-Phe808。

2.6.3 ACE2編碼蛋白質跨膜結構和信號肽分析

利用TMHMM在線軟件進行蛋白質跨膜結構分析，該白羽肉雞ACE2蛋白屬于Ⅰ型跨膜蛋白，同已鑒定的人、羊等ACE2蛋白一致。其中第1-739氨基酸為胞外部分，第740-762氨基酸之間有一個跨膜螺旋，第763-805氨基酸為胞內部分。

利用SignalP在線軟件進行信號肽分析，預測第17-18氨基酸之間存在潛在的裂解位點，且該蛋白為分泌蛋白，信號肽區域在第1-17氨基酸之間。

2.7 蛋白質磷酸化分析

利用NetPhos2.0Server對ACE2基因編碼蛋白質進行磷酸化位點預測，白羽肉雞ACE2蛋白質有87處磷酸化位點，其中較多的是Thr(32處，36.78%)和Ser(37處，42.63%)，Tyr18處，20.69%)。

2.8 蛋白質高級結構預測與分析

利用Phyre2.0軟件預測蛋白質的三級結構，結果如圖8顯示，白羽肉雞ACE2蛋白質序列與c2c6nA(血管緊張素轉換酶)模板序列覆蓋率高達74%，該蛋白質存在較多的扭曲，結構較為豐富，該結果同時也表明了白羽肉雞ACE2由α螺旋、β折疊和無規則卷曲組成，與二級結構預測一致。

A. ACE2編碼蛋白質三級結構預測構象圖；B. A圖旋轉180°所得構象圖

圖8 白羽肉雞ACE2編碼蛋白質三級結構預測

3 討論

2000年，Donghuee等[1]首先從心力衰竭患者的cDNA文庫中通過轉染CHO細胞的方法擴增出ACE2基因全長，由2 418個核苷酸組成，編碼805個氨基酸，自此開始了ACE2的多方面研究。已經 證實ACE2作為腎素 血管緊張素(renin-angiotensinsystem, RAS)系統的負調節分子，通過靶向降解AngⅡ，發揮抗損傷、抗纖維化等機體保護功能[7]；而且作為急性嚴重呼吸系統綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)主要功能性受體，具有保護肺損傷的功能[8-9]，ACE2還在協同氨基酸轉運載體轉運，與氨基酸吸收不良、腸道微生態平衡和胃腸道炎癥發揮重要作用[10]。ACE2的作用及其應用引起了國內外學者的廣泛關注，已成為人醫臨床研究的一個熱點和前沿領域。

目前 ，ACE2的研究主要集中在人、小鼠、大鼠、貓、綿羊、豬以及斑馬魚等多種哺乳動物及水生動物，但是在家禽白羽肉雞方面的研究未見報道。 本研究以白羽肉雞為研究對象，應用RT-PCR檢測ACE2在白羽肉雞上分布，證實其在 腎臟、十二指腸、回腸、盲腸、空腸組織有存在。

有關ACE2基因及其功能方面的研究在動物上的起步較晚，GenBank上缺乏動物ACE2基因的基本信息資料。2009年，香港大學研究者在GenBank上第一次登錄了野豬ACE2的 mRNA序列，基因全長為2 361 bp，編碼786個氨基酸，基因序列編號為GQ262781[11]。2010年，Tseng等[12]克隆出長白豬的ACE2基因。2015年，楊維維等[13]從山羊腎臟中克隆出ACE2基因全長，大小2 415 bp，編碼805個氨基酸，序列登錄號為KF921008.1。通過序列分析發現山羊ACE2蛋白屬于Ⅰ型跨膜蛋白，且具有分泌性，其信號肽序列位于第1-18氨基酸之間。2018年肖航[14]對斷奶仔豬ACE2基因序列進行了克隆，發現斷奶仔豬ACE2全基因序列為2 418 bp，編碼805個氨基酸。通過跨膜螺旋分析及蛋白信號肽區域預測顯示斷奶仔豬ACE2蛋白也屬于Ⅰ型跨膜分泌性蛋白，其信號肽序列位于第1-17氨基酸之間。本研究對白羽肉雞的ACE2基因進行了克隆，全基因序列分析顯示，CDS區由2 444個堿基對組成，共編碼808個氨基酸，得到的ACE2序列已提交到GenBank(登錄號為MK560199)。進一步生物信息學分析發現該基因編碼的產物中親水性氨基酸占比較大，總體表現為疏水性。通過信號肽預測表明，白羽肉雞ACE2蛋白信號肽在1-17氨基酸之間，屬于分泌性蛋白，有1個跨膜結構域，這與楊維維等[13]對山羊及肖航等[14]對斷奶仔豬ACE2研究分析得出的結果一致。

通過對蛋白質的空間結構分析預測，該基因編碼產物的二級結構中α-螺旋和β-折疊比率比較大，分別為48.62%和33.95%；無規則卷曲占比較小，為17.43%。在分子進化分析發現該片段與家豬氨基酸序列處于同一進化群中，與牛和山羊處于完全不同的兩個分支中，與氨基酸進化結果一致。細胞內分布發現該白羽肉雞ACE2主要在細胞膜、內質網、細胞質內發揮其生物學作用，同時具有較長的半衰期和不穩定系數，編碼的產物總體表現為不穩定的蛋白。通過蛋白修飾的磷酸化、糖基化分析預測，整條多肽鏈共有87個磷酸化位點，無O-糖基化位點，主要是N-糖基化位點。

綜上，本研究首次對中國白羽肉雞ACE2分布進行了探討，通過克隆等分子生物學技術獲得白羽肉雞ACE2基因全長序列，并對其基因結構、核苷酸及氨基酸組成、蛋白特性等進行了預測分析，為ACE2在白羽肉雞及禽類方面的研究提供了基礎資料。