羊傳染性膿皰病毒疫苗株和野毒株GIF基因比較分析

張大俊，盧炳州，閆鳴昊，郝軍紅，鄭海學，劉湘濤，張克山

(中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室/國家口蹄疫參考實驗室，甘肅 蘭州 730046)

羊傳染性膿皰(orf)是副痘病毒屬(parapoxvi-rus)的羊傳染性膿皰病毒(orf virus, ORFV)感染引起的綿羊、山羊和人的人獸共患病[1-2]。典型病理過程最初紅斑、囊泡形成，然后到膿皰，最后形成結痂斑[3-4]。臨床特征主要表現為嘴唇皮膚上，口腔黏膜和鼻孔周圍出現增殖性并且通常是自限性損傷。哺乳動物的乳頭上偶有發病，其他部位很少發現病變[5]。

該病對山羊感染率高，致死率低，但是繼發或混合感染其他病原后，可導致較高死亡率[6]。ORFV感染可對我國農業經濟產生重大影響[7]。ORFV基因組是全長為135kb的線性雙鏈(ds)DNA[8]，有16個開放閱讀框，G+C的組成約為63%[9]。基因組的中心部分含有病毒復制和病毒形態發生變化所必需的高度保守的基因，位于末端的可變基因主要與病毒的毒力和發病機制有關[10]。GIF基因位于ORFV基因組的右端，研究表明這段基因序列的存在可能是病毒與宿主在相互適應過程中發生了基因重組，并在感染后的中晚期表達[11-12]。通常情況下，GIF以同源二聚體和四聚體的形式與綿羊粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的369KD和IL-2的1.04KD高親和力結合[13]。由于羊和人兩者的GM-CSF及IL-2受體不同，所以GIF不能與人的GM-CSF和IL2結合。GIF功能活性表明，其能抑制綿羊GM-CSF的造血活性，并在T細胞增殖試驗中抑制綿羊IL-2的生物活性。對感染部位局部免疫反應的研究表明病毒具有破壞適應性免疫反應的作用[14]。ORFV二次感染綿羊后，在其淋巴液中均能檢測到GM-CSF和IL-2[15]，這些細胞因子主要來源于CD4 + T細胞[14]。GIF通過抑制GM-CSF和IL-2在免疫反應中的作用，從而逃避機體的免疫監視。由于GIF的特殊性以及作為眾多病原體免疫調節劑的一部分，不僅可用于確定病毒致病機制和宿主抗病原體免疫的性質，還可作為潛在治療蛋白質或肽的模板[16]。上述研究表明GIF基因在ORFV感染宿主的過程中發揮重要作用[17]。

目前，疫苗接種仍然是ORF防控主要措施[18]。由于ORFV的免疫反應主要是依靠細胞免疫，因此細胞弱毒疫苗效果較好，但毒株致弱機制尚不清楚。為此本試驗對ORFV疫苗株和野毒株的GIF基因序列進行了比較分析，并進行氨基酸序列的推導及蛋白質結構比較分析。本試驗結果為闡明ORFV自身編碼的基因GIF在疾病防控中的作用提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料及主要試劑

疫苗購買于山東泰豐生物制品有限公司；病料于2018年采集于西北地區某羊場患病羔羊的唇部痂皮。DNA提取試劑盒Dneasy Blood&Tissue kit 購自QIAGEN公司；EXTaqDNA聚合酶、dNTP等購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 引物設計

依據引物設計原則，參考 GenBank中ORF GIF基因的全序列設計引物如下上游引物為5′GCTCTAGGAAAGATGGCGTG 3′，下游引物為5′GTACTCCTGGCTGAAGAGCG 3′。引物由Thermo Fisher Scientific公司合成。

1.3 DNA的提取

按照Dneasy Blood&Tissue kit 試劑盒分別抽提疫苗和病料核酸。

1.4 PCR擴增

反應體系(50 μL)為：5×PCRbuffer 10 μL，primerstar酶0.5 μL，模板1 μL，P1、P2各1 μL，dNTP 5 μL，補加超純水至50 μL。反應條件為：95 ℃ 預變性5 min ；94 ℃ 變性 50 s，56.5 ℃退火50s，72 ℃延伸1 min，35個循環后，72 ℃延伸10 min。取5 μL 擴增產物經 1% 瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增結果。

1.5 序列測定及比較分析

經電泳檢測片段大小合適的擴增產物附上下游引物送出測序。利用DNAStart軟件中 MegAlign程序將測序確證的野毒株與疫苗株GIF基因序列進行比對，分析其在核苷酸和氨基酸水平的變異情況。將測定的序列與NCBI上已公布的ORFV GIF基因序列(表1)進行比對分析。

1.6 蛋白質一級結構及理化性質分析

運用Expassy在線工具包中的ProtParam分析ORFV疫苗株和野毒株編碼的GIF蛋白的氨基酸組成及各種理化性質。

1.7 蛋白質二級結構及功能分析

用DNAStar中Protean程序對ORFV疫苗株和野毒株編碼的GIF蛋白進行二級結構預測。用Expasy在線工具包中的Signal IP進行信號肽預測，用 TMHMM2.0中的SOSU進行跨膜區預測。根據蛋白質的疏水性分析，表面可能性分析以及抗原指數分析結果綜合氨基酸的帶電量等情況，分析兩蛋白可能的抗原優勢表位。

1.8 蛋白質三級結構分析

將疫苗株與野毒株的GIF基因推導的氨基酸序列提交至Swiss-Model進行三維結構預測，建立模型并進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 GIF基因擴增

以提取的病毒DNA為模板，用設計的引物進行 PCR 擴增，得到約798 bp大小的片段，與預期結果相符。

2.2 序列測定與分析

符合預期結果的片段經測序得到大小為798bp的GIF基因序列。將野毒株與疫苗株的GIF基因序列進行比較，兩者的核苷酸序列同源性為 94.3%，差異主要為單個堿基的突變，集中在CT堿基的替換。其他有少量其他堿基的突變，且野毒株大小長度比疫苗株少3bp。2個毒株GIF的氨基酸序列進行推導相似性為92.5%，氨基酸在第11位(Phe→Leu)、30位(Met→Thr)、46位(Val→Ile)、56位(Asn→Ser)、73位(Gly→Asp)、74位(Val→Arg)、77位(Gly→Ala)、85位(Val→Met)、86位(Pro→Ala)、94位(Ser→Met)、112位(Asp→Tyr)、115位(Thr→Ser)、120位(Val→Ala)、170位(Asp→Val)、173位(Asn→His)、175位(Ser→Gly)、194位(Leu→Gin)、202位(Thr→His)、234位(Ser→Cys)、258位(Glu→Lys)發生了變異。這些氨基酸的突變是否能夠引起結構的變化，來進一步影響其蛋白功能的發揮，還需作進一步的分析。

本次測定的ORFV野毒株與疫苗株的GIF基因序列與GenBank公布的其他毒株(表1)進行比對，發現本次測定的ORFV野毒株GIF的核苷酸序列與其他毒株的相似性為88.3%～99.2%，其中與2013年公布的ORFV中國新疆石河子株GIF(KF726847.1)相似度最高，相似性為99.2%。而本次測定的ORFV疫苗株GIF基因序列與其他毒株的相似性為88.8%～99.0%。其中2011公布的ORFV芬蘭野毒株株GIF(JF773686.1)與本次測定的ORFV疫苗株GIF序列相似性最為接近為99.0%(圖1)。通過系統進化樹分析，本次測定的ORFV野毒株GIF與2013 年公布的中國新疆石河子株GIF(KF726847.1)較為接近(圖2)。從進化樹中選取2012年公布的中國新疆株GIF(KF666567.1)、2017年公布的中國安徽株(MF489147.1)與本次測得的疫苗株進行深入比較。將這兩個野毒株GIF分別與疫苗株GIF的氨基酸序列進行推導，中國安徽株(MF489147.1)與疫苗株有15處變異，中國新疆株(KF666567.1)疫苗株有14處變異，且它們在第30位(Met→Thr)、56位(Asn→Ser)74位(Val→Arg)、85位(Val→Met)、86位(Pro→Ala)、115位(Thr→Ser)、120位(Val→Ala)、170位(Asp→Val)、234位(Ser→Cys)發生同樣的變異。

表1 ORFV GIF基因序列信息

序號毒株名稱登陸號國家年份宿主1ORFV 野毒株(本研究使用)未上傳中國甘肅2018山羊2ORFV 疫苗株(本研究使用)未上傳中國甘肅2018山羊3芬蘭07.798R株JF773680.1芬蘭2011馴鹿4芬蘭07.808R株JF773686.1芬蘭2011馴鹿5中國新疆2株KF666566.1中國新疆2013山羊6中國新疆1株KF666567.1中國新疆2012山羊7中國石河子3株KF726847.1中國石河子2013山羊8中國河北1株KJ610834.1中國河北2010山羊9中國河北株KJ610835.1中國河北2010山羊10美國阿拉斯加北美山羊2006-29株 KM057383.1美國2006北美山羊11美國阿拉斯加北美馴鹿2012-137株 KM057394.1美國2012北美馴鹿12阿根廷sCh97株KP244331.1阿根廷1997羊13中國安徽AH1505株MF489141.1中國安徽2015山羊14中國安徽AH1610株MF489144.1中國安徽2016山羊15中國安徽AH1612株MF489145.1中國安徽2016山羊16中國安徽AH1704株MF489147.1中國安徽2017山羊17中國安徽AH-GY13株MF770655.1中國安徽2013山羊18印度阿薩姆邦2014株MF414636.1印度2014山羊19印度查爾邦MUK59/05株DQ922634.1印度2007山羊20印度比卡內爾09株GU460372.1印度2008駱駝

2.3 蛋白質性質、結構與功能分析

2.3.1 蛋白質一級結構及理化性質分析

把ORFV疫苗株與本次野毒株的GIF及2012年公布的中國新疆株GIF(KF666567.1)、2017年公布的中國安徽株(MF489147.1)蛋白氨基酸序列提交到在線工具Eexpasy進行分析，結果顯示疫苗株和3個野毒株GIF蛋白的相對分子質量分別為29 805.12、29 739.93、29 963.36、30 306.61，理論等電點分別為7.61、6.06、6.54、6.35。總平均疏水指數、脂肪系數、不穩定指數、半衰期等理化性質上均有相似的特征。疫苗株與三個野毒株GIF蛋白均為親水性不穩定蛋白，四者的總平均疏水指數分別為-0.220、-0.177、-0.173、-0.195，不穩定指數分別為48.15和45.40、48.09、47.94。

圖1 ORVF不同毒株編碼的 GIF基因核苷酸水平同源性分析

圖2 不同毒株 ORVF GIF基因系統發育樹

2.3.2 高級結構及功能分析

根據預測結果，ORFV疫苗株與野毒株編碼的 GIF蛋白的二級結構都以α螺旋為主，其他如 β折疊、 轉角、無規則卷曲結構分布較少且分散(圖3)。疫苗株GIF蛋白在1-100aa區段的α螺旋數目比本次測得野毒株GIF蛋白在1-100aa區段的α螺旋數目要多，與國內其他兩支野毒株的數目一樣，但分布有區別。三個野毒株GIF蛋白在區段40-120aa β轉角結構分布密集，而疫苗株在該區段的β轉角數目分布稀少。利用TMHMM2.0工具包分析預測跨膜區可知疫苗株和三個野毒株的GIF蛋白的預測結果均無跨膜區(圖4)。用 SignalIP進行信號肽預測，結果均表明有信號肽的可能性極小，幾乎為零。推導的氨基酸序列提交在線工具Swiss-Model分析得到三維結構預測(圖5)，可以看出疫苗株和三個野毒株GIF蛋白的三維結構在N、C兩端并無明顯差異，但在氨基酸序列238-256位無規則卷曲區域三個野毒株均比疫苗株的卷曲程度大。

A.α螺旋區段；B.β折疊區段；T.轉角區域；C.無規則卷曲區域

A.疫苗株；B.野毒株；C新疆株；D安徽株

圖4 ORFV GIF蛋白跨膜區

A.疫苗株；B.野毒株；C新疆株；D安徽株

3 討論

ORFV感染機體后，首先刺激機體啟動免疫系統，導致各種先天免疫細胞誘導趨化因子和細胞因子的分泌，從而抵抗病毒的侵襲[19]。在與不同宿主的作用中，ORFV通過自身編碼的毒力因子，進化出了一種免疫逃避的策略。多年來，ORFV與宿主免疫系統相互作用一直是研究的熱點[20]。ORFV的開放閱讀框ORF117基因，即GIF基因是在病毒感染的中晚期表達，編碼的毒力蛋白能夠抑制宿主免疫活性[16]。研究證實GIF缺失基因的病毒重組體在復制后很難進行組裝，但其具體的分子機理并不清楚[21]。GIF是一種特異性的雙重細胞因子結合蛋白，能夠與GM-CSF、IL-2結合,并抑制二者活性，且僅有副痘病毒屬成員才編碼GIF基因[22]。鑒于GIF基因在ORFV致病中的重要作用，GIF基因的變異可能導致其致病的減弱，是開發弱毒疫苗的主要靶向基因。

本試驗對ORFV的GIF疫苗株和野毒株基因序列進行生物學信息比較分析，結果顯示疫苗株和野毒株基因克隆的GIF基因組全長各為798 bp、795bp，各編碼265、264個氨基酸。ORFV的GIF疫苗株和野毒株核酸相似性分析結果顯示為94.3%，差異主要為單個堿基的突變，集中在CT堿基的替換。兩者的氨基酸序列相似性進行推導的結果氨基酸位點有20處發生了變異，同時把疫苗株與中國安徽株(MF489147.1)、中國新疆株(KF666567.1)進行比較也分別有15、14處變異，并且它們有9處發生同樣的變異。這些氨基酸位點的變異導致野毒株和疫苗株在40-130、150-189、200-260位點氨基酸殘基形成α螺旋、β折疊、無規則卷曲的概率的變化。ORFV的GIF疫苗株和野毒株基因都無跨膜區，親水性區域相同且有信號肽的可能性較小。在理論等電點方面疫苗株比野毒株的都大，但3個野毒株的很接近，它們相對分子質量方面也有差異。預測的二級結構中疫苗株比本次克隆的野毒株少出9個β折疊區段，多6個無規則卷曲區域。疫苗株與另外兩個野毒株相比也符合這一趨勢，但在數目上沒有那么大的差別，這些變化與氨基酸位點突變密切相關。氨基酸殘基的改變導致其編碼蛋白親水性發生變化，也可能使B細胞表位產生差異。由于蛋白質二級結構中α螺旋、β折疊的化學鍵能較高，能較牢固的固定蛋白質高級結構，且經常處于蛋白質內部[23]，因此這些變化說明羊傳染性膿皰病毒毒力的強弱可能和這類氨基酸位點突變有關。預測的三維結構有一定的區別，應該是一、二級結構變化導致三級結構的差異。

本研究通過對ORFV疫苗株與野毒株GIF基因進行比較分析，發現了二者在一、二、三級結構的差異。本結果為進一步研究GIF蛋白功能提供了新線索，同時闡明ORFV自身編碼的基因GIF在疾病防控中的作用提供了參考依據。