超聲-微波協同提取百香果皮果膠的工藝研究

黎英 劉夏蕾 林婭新 陳雪梅

摘? 要：以果膠得率為分析指標，采用超聲微波協同提取百香果干果皮果膠，利用響應面分析法優化其工藝條件。結果表明，百香果皮果膠超聲微波協同提取的最佳工藝參數為：液料比30 mL/g，pH 2.0，溫度50 ℃，水浴60 min，超聲功率50 W、微波功率600 W、超聲-微波時間8.0 min，在此條件下，果膠得率可達（12.14±0.06）%。超聲-微波協同法的提取效果與單獨水提、超聲、微波法的相比，得率分別提高了47.33%、34.74%和23.50%，3種提取方法的酯化度均≥50%，其說明百香果皮果膠屬于高甲氧基果膠。掃描電鏡結果顯示，百香果皮細胞壁在超聲微波協同作用下破碎更為徹底，利于果膠溶出。

關鍵詞：百香果皮;果膠;超聲-微波協同提取;掃描電鏡

中圖分類號：S667.9????? 文獻標識碼：A

Abstract： The extracting rate of the pectin was used as the analytical index， and the ultrasonic-microwave synergistic extraction of dried fruit peel pectin from passion fruit was optimized by the response surface methodology. The optimum process parameters of the ultrasonic-microwave synergistic extraction of the peel of passion fruit were obtained， namely liquid to material ratio 30 mL/g， pH 2.0， temperature 50?℃， water bath 60 min， ultrasonic power 50 W， microwave power 600?W， ultrasonic-microwave time 8.0?min. Under the condition， the yield of pectin could reach （12.14±0.06）%. Compared with water extraction， ultrasonic and microwave methods， the extraction rate of ultrasonic-microwave synergy method increased by 47.33%， 34.74% and 23.50%， respectively. The esterification degree of the four extraction methods was≥50%， indicating that the peel pectin of passion fruit was a high methoxyl onein. The results of scanning electron microscopy showed that the cell wall of the fruit peel was broken more thoroughly under the synergistic effect of ultrasound-microwave， which was beneficial to the dissolution of pectin.

Keywords： peel of Passiflora edulis; pectin; ultrasonic-microwave synergistic extraction; scanning electron microscopy

百香果（Passiflora edulis Sims.）又名西番蓮、雞蛋果，為半木質藤本攀緣或多年生常綠草質植物，在我國臺灣、海南、廣東、福建等地種植歷史較長，并產生了一定的商業規模。其富含果膠、多糖、黃酮類、生物堿類、多酚類、維生素A和C、膳食纖維以及礦物Ca、Mg、Fe、Zn、Se、K等160多種有益成份，具有生津止渴、護膚養顏、化痰止咳、防癌抗衰、安神抗焦慮、抗炎抑菌等多種醫藥保健功效，因而也被譽為“果中之王”[1-4]。

百香果種植業的迅速發展，但隨之帶來百香果鮮果價格下降和售賣難等問題，且百香果皮水分含量高，貯藏困難、易腐爛變質等問題也存在。此外，整個百香果鮮果中，果皮約占50%～55%。但現階段國內加工企業對百香果的產品開發主要集中在果肉飲料加工，利用百香果皮所生產的制品受限于技術等原因，主要是初加工產品，如果脯、果醬及蜜餞類等食品，產品種類單一，生產總量少，加工水平較低，附加值也不高。

熱水浸提法仍是目前提取植物果膠采用的常見方法之一，此法雖使用儀器少，操作簡單，但得率低且耗時。微波和超聲輔助萃取近年來作為一種新興提取技術被廣泛地用于植物果膠提取。微波是一種具有較強穿透力的非離子電磁輻射，通過相互摩擦撕裂產生高效電介質熱和內熱，從而快速傳遞能量，加快植物中有效成分的溶出及擴散，縮短提取時間[5-8]。超聲提取利用其空化作用使水介質產生高強度的微射流和機械振動，形成高強度的剪切和沖擊力從而使細胞壁穿透性增加，促進細胞內有效成分溶出[9-11]。將上述2種方法協同使用，可在短時間內充分利用微波高能效應與超聲波空化效應，實現對細胞快速、高效的處理，加速有效成分的溶出，從而大大減少萃取時間、降低能耗、提高萃取效率[12-15]。目前，對百香果皮果膠提取主要采用單一水提或超聲或微波輔助等方法，尚無超聲微波協同提取的百香果皮果膠的研究報道。本研究采用超聲微波雙輔助協同提取百香果皮果膠，利用響應面法優化該工藝的提取條件，并與單一水提或超聲或微波輔助提取效果進行比較，同時采用掃描電子顯微鏡初步分析了百香果皮在提取前后的微觀結構變化，旨在為百香果皮的精深加工及綜合開發利用提供依據，亦可為產業化提取百香果皮果膠提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 百香果鮮果皮（紫紅色）由龍巖道心農業發展有限公司提供，將百香果皮清洗，烘干，粉碎過80目篩后備用。咔唑（P）、D-（+）-半乳糖醛酸，Sigma公司;C2H5OH、H2SO4、HCl，均為國產分析純。

1.1.2? 儀器與設備? CW-2000超聲-微波協同萃取/反應儀，上海新拓分析儀器科技有限公司;EYELA N-1300旋轉蒸發儀，日本東京理化公司;MS204TS電子分析天平，梅特勒托利多儀器上海有限公司;JB-4定時雙向電子恒溫磁力攪拌器，江蘇常州德杜精密儀器有限公司;ZD-2自動電位滴定儀，上海精密科學儀器有限公司;100～1000 μL移液器，德國Eppendorf;ST16R高速冷凍離心機，美國Thermo;UV-800雙光束紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司;UB-7?pH計，美國丹佛;XWDJ-350渦輪式粉碎機，浙江新世紀粉碎設備有限公司;FDV超細微粉碎機，燕山正德;S-3400N掃描電子顯微鏡，日本Hitachi。

1.2? 方法

1.2.1? 半乳糖醛酸標準曲線的繪制? 參考李梅等[16]和張英楠等[17]的方法略改：精確稱取D-半乳糖醛酸標準品0.100?g，溶解于水中，定容至100 mL，混勻得1 mg/mL D-半乳糖醛酸原液。取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL分別注入10 mL容量瓶，定容得一組半乳糖醛酸標準溶液（質量濃度為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 μg/mL）。取10支50 mL比色管加入1 mL不同質量濃度的半乳搪醛酸標準溶液，再分別沿比色管壁加入6?mL濃H2SO4混勻，置于沸水浴中反應20 min，冰浴降至室溫。最后加入質量濃度為0.15%咔唑-乙醇溶液0.5 mL，搖勻靜放在暗處顯色60 min，在528 nm處測定其吸光度，每組實驗平行3次，0號管為參比。以半乳糖醛酸質量濃度（x）為橫坐標，吸光值（y）為縱坐標，繪制出標準曲線。

1.2.2? 百香果皮果膠的制備? （1）百香果皮果膠的提取。稱取5.0 g百香果皮粉末，按設定的每組實驗提取條件，加入一定體積的蒸餾水，檸檬酸調節pH，50 ℃水浴60 min后，按預設超聲微波協同萃取/反應儀（超聲功率50?W）處理條件進行提取，提取液真空抽濾，將濾渣相同條件重復操作2次，合并濾液真空濃縮后用4倍體積的95%乙醇過夜，濾餅（用乙醇反復洗滌2次）真空冷凍干燥，即得百香果皮果膠。

（2）百香果皮果膠的得率測定。稱取獲得的果膠樣品蒸餾水復容后，精密移取一定體積稀釋，稀釋液按1.2.1標準曲線制備方法平行測定3次吸光度值，用下面公式計算百香果皮果膠得率：

式中，C為樣品的半乳糖醛酸濃度（μg/mL）;Ⅴ為果膠總體積（mL）;N為稀釋倍數;W 為百香果皮粉質量（g）。

（3）百香果皮果膠酯化度的測定。參考周小敏等[18]、梅新等[19]和Pinheiro等[20]的方法略改：稱取0.500 g果膠粉末，加少量無水乙醇潤濕后加50 mL蒸餾水，置于磁力恒溫攪拌器上攪拌至溶解，加入酚酞1滴，NaOH（0.1 mol/L）滴定至剛變色并記錄消耗體積（V1），繼續加入10?mL?NaOH（0.1?mol/L），混勻后室溫靜置2 h，再加入10?mL?HCl（0.1 mol/L），最后用NaOH（0.1?mol/L）滴定至剛變色并記錄消耗體積（V2）。每組重復3次。按以下公式計算果膠的酯化度。

式中，V1——NaOH初始消耗體積（mL）;V2—— NaOH終點消耗體積（mL）。

1.2.3? 百香果皮果膠超聲微波協同提取的條件優化? （1）百香果皮果膠超聲微波協同提取單因素實驗。稱取5.00?g百香果皮粉末，50?℃水浴60?min后，預設提取工藝參數中的常規量為液料比30?mL/g，pH?2.0，微波時間5.0?min，微波功率450?W，按1.3.2步驟操作，分別考察pH（0.5～3.0），液料比（10～60?mL/g），微波功率（200～ 700 W），微波時間（2.0～12.0 min）對百香果皮果膠得率的影響。

（2）響應面分析百香果皮果膠超聲微波協同提取實驗設計。在上述單因素實驗基礎上，以果膠得率為響應值，液料比（A），pH（B），微波功率（C），微波時間（D）為自變量，采用四因素三水平的Origin 8.6軟件設計（見表1）。

1.2.4? 不同提取方式的比較? （1）提取效果對比實驗。采用本研究中的超聲-微波協同法得到的優化參數，與水提法、超聲法和微波法進行對比實驗，比較不同方法的提取效果。

（2）百香果皮果膠提取后殘渣SEM（掃描電鏡）對比實驗。將水提、超聲、微波和超聲-微波協同提取殘渣真空干燥，此4種殘渣粉末及百香果皮粉末（對照），于離子濺射儀中真空鍍金，利用SEM進行微觀結構分析。

1.3? 數據處理

每組實驗均重復進行3次，運用SAS 8.1、Origin 8.6和SPSS 20.0軟件進行數據處理與統計分析，數據以平均值±標準差表示。

2? 結果與分析

2.1? 百香果皮果膠含量測定標準曲線

由標準半乳糖醛酸質量濃度（x）與對應的吸光度（y）的關系，獲得半乳糖醛酸標準曲線的回歸方程y=0.005x0.0052（R2=0.9989）（圖1），在0～90?μg/mL范圍內呈現良好的線性關系。

2.2? 單因素實驗的結果與分析

影響百香果皮果膠得率的單因素實驗結果見圖2，其中液料比的得率，隨液料比的增加而增加。當液料比在30～50 mL/g時增幅無顯著差異，之后卻有所下降。可能是因為溶質的擴散和溶出主要受傳質動力影響。當提取溶劑和溶質之間的濃度差達到30?mL/g左右時，液料體系已達到動態平衡，即果膠基本被充分提取。當液料比超過50?mL/g后，可能因隨溶劑的增加會相應加大其對超聲微波的能量消耗，導致溶質所吸收的能量下降，得率下降。綜合考慮后續的濃縮操作和耗能成本等因素，料液比選擇30 g/mL為宜。

百香果皮果膠的得率，隨pH的增大先增加后下降，在pH 2.0左右時達最大值。這是由于在一定的酸度條件下，原果膠會分解成果膠，果膠會分解為甲醇和果膠酸，且果膠的溶出跟果皮組織結構的破壞力有關。當酸度較大時，果膠被分解，而超過pH 2.0后，隨著酸度的降低對果皮組織破壞力相應減弱，果膠溶出也相應減少，故得率都較低。因此，選擇pH 2.0最適宜。

隨著微波功率的增加，百香果皮果膠得率呈現先上升后降低的趨勢，這可能是因為當功率較小時微波的熱效應較弱，導致原料內部的溫度過低不利于果膠的溶出和擴散。當微波功率過大時可能會迅速增大體系壓力使溶劑局部溫度過高，造成百香果皮中一些其他雜質溶出，果膠溶出減少從而使得率下降。同時功率過高原料容易溢出，易引起實驗誤差。因此，微波功率選擇600 W比較適宜。

百香果皮果膠的得率，隨微波時間的延長先升高后下降，可能是因為處理時間過短時溶液的內部溫度和壓力值過小，使果皮中果膠溶出不夠徹底，產率低。但微波處理時間過長會使果膠降解程度加大，導致得率下降。因此，微波時間宜選擇8 min較為合理。

2.3? 響應面優化百香果皮果膠提取工藝的結果與分析

2.3.1? 優化百香果皮果膠提取工藝的設計與結果??? 根據上述百香果皮果膠提取的單因素實驗結果，以百香果皮果膠得率為分析指標，利用Origin 8.6軟件進行方案設計與分析，獲得結果見表2。

對表2中的各因素和指標的實驗數據進行回歸擬合，可得各因素變量與百香果皮果膠得率（R）間的二次響應面回歸模型。

2.3.2? 響應面優化百香果皮果膠提取實驗的方差分析結果? 為進一步闡明各因素對百香果皮果膠得率的影響程度和二次響應面回歸模型的有效性，對上述二次響應面模型進方差分析，其結果見表3。

從表3可以看出，A（液料比）、B（pH）、C（微波功率）、D（微波時間）對百香果皮果膠得率的貢獻率為：B>C>D>A。對百香果皮果膠得率影響中除了A、CD不顯著（P>0.05）及C、D、AC和BC影響顯著（P<0.05）外，其余的均達到極顯著水平（P<0.01）。此吸附模型極顯著（P< 0.0001），失擬項P =0.5703>0.05不顯著，表明實驗設計誤差小，該實驗模型比較理想;模型的決定系數R2=0.9907，且校正決定系數Adj.R2= 0.9814，變異系數CV=0.80%，可看出實驗結果可靠回歸方程擬合程度良好，能較精準預測和分析液料比、pH、微波功率和微波時間對果膠得率的影響。

表3? 百香果皮果膠得率模型回歸方差分析

Tab. 3? Analysis of variance for the fitted regression equation for tthe extraction yield of pectin from peel of P. edulis

方差來源

Variance source???? 平方和

Sum of squares????? 自由度

DF?? 均方

Mean square?? F值

F value??? Prob>F?? 顯著性

Significant

模型?????? 9.87 14??? 0.71 106.53 ? <0.0001? **

A???? 0.015????? 1???? 0.015????? 2.22 ????? 0.1584

B???? 0.075????? 1???? 0.075 ??? 11.36????? 0.0046??? **

C???? 0.051????? 1???? 0.051????? 7.66 0.0151??? *

D???? 0.049 ??? 1???? 0.049 ??? 7.46 ????? 0.0162??? *

AB? 0.10 ????? 1???? 0.10 ????? 15.47????? 0.0015??? **

AC? 0.040????? 1???? 0.040????? 6.04 ????? 0.0276??? *

AD? 0.12 ????? 1???? 0.12 ????? 18.50 ??? 0.0007??? **

BC?? 0.036 ??? 1???? 0.036 ??? 5.45 ????? 0.0349??? *

BD? 2.15 1???? 2.15 324.16 ? <0.0001? **

CD? 0.014 ??? 1???? 0.014????? 2.17 ????? 0.1624

A2?? 3.44 1???? 3.442????? 519.11 ? <0.0001? **

B2?? 2.29 1???? 2.29 345.87 ? <0.0001? **

C2?? 1.17 ????? 1???? 1.17 ????? 177.31??? <0.0001? **

D2?? 3.96 ????? 1???? 3.96 ????? 598.60 ? <0.0001? **

殘差?????? 0.093????? 14??? 6.621E-003

失擬項??? 0.065 ??? 10??? 6.529E-003??? 0.95 ????? 0.5703??? 不顯著

純誤差??? 0.027 ??? 4???? 6.850E-003

總和?????? 9.97 ????? 28

注：**表示差異極顯著（P<0.01）;*表示差異顯著（P<0.05）。

Note： ** indicates extremely significant difference （P<0.01）; and * indicates significant difference （P<0.05）.

2.3.3? 各因素對百香果皮果膠得率的交互作用的結果與分析? 從圖3描繪的各因素三維響應面圖和等高線圖中可直觀看出，液料比對百香果皮果膠得率影響最小，pH的影響最大，微波功率和時間影響其次。具體體現在其對應的曲面傾斜度越來越陡峭和等值線的形狀越來越密集。利用軟件預測獲得最佳條件為：液料比29.91?mL/g，pH 2.03，微波功率608.30?W，微波時間8.01?min，得率最大理論值為12.20%。考慮實際操作可行性，以上條件修正為液料比30 mL/g、pH 2.0、微波功率600 W、微波時間8.0 min。

2.3.4? 優化條件下百香果皮果膠得率的驗證實驗? 按上述優化后的條件（超聲功率50?W、液料比30 mL/g、pH 2.0、微波功率600 W、超聲-微波時間8.0?min）進行3次平行實驗，果膠得率為：

（12.14±0.06）%、（12.15±0.13）%、（12.07±0.07）%、（12.20±0.04）%，RSD=0.59%，實際值與其預測值相對誤差為0.54%。因此，該回歸方程模型優化得到的百香果皮果膠提取工藝參數組合準確度高，可有效、可靠地指導實際操作。

2.4? 不同提取方法的比較結果與分析

2.4.1? 提取效果的實驗結果與分析? 由表4可以得出，超聲-微波協同提取與單一的水提、超聲和微波提取相比得率分別提高了47.33%、34.74%和23.50%，且具有提取時間短、節能等優點。分析其原因，可能是相比單一的水提、超聲和微波提取，超聲-微波協同提取可在短時間內協同利用適宜的微波熱效應和超聲波的空化作用，加快對百香果皮細胞結構地破壞，更有利于果膠的釋放，進而大幅度提高果膠得率[15]。4種方法提取的果膠酯化度均≥50%，故百香果皮果膠屬于高甲氧基果膠。其中超聲-微波協同法提取的百香果皮果膠酯化度最高，其次是超聲波和微波提取的，水浴提取的酯化度較低。這可能因為水浴提取對果膠結構的破壞程度最小，可使甲氧基和乙酰基得以更多地保留。而超聲波和微波在提取過程中產生了強烈的空化和化學效應，對直鏈和支鏈的結構造成更大破壞，果膠鏈上羧基大部分被取代，導致酯化度上升。

2.4.2? 掃描電鏡的觀察結果與分析? 不同方法提取前后百香果皮渣的微觀結構由掃描電鏡觀察結果如圖4所示，可以看出與未經過處理的對照組（1）相比，采用水浴處理后百香果皮渣的組織結構由緊密變得松散，超聲處理后結構更加膨脹、均勻，微波提取后體積明顯增大、結構也更蓬松，而超聲微波協同后則使結構破壞最嚴重，變得更加細碎、膨大、疏松。這是可能由于超聲波的機械振動及撞擊作用產生了強烈的沖擊波，使百香果皮的組織破裂;微波能在短時間高效加熱升溫，使細胞內部急劇升溫，結構變得膨大;而超聲微波協同可同時接受超聲波的空化效應與微波特有的機械和熱效應，更徹底地破壞了百香果皮渣的表面結構，組織結構形成細碎、膨脹、松散，導致有效成分充分快速溶出，從而提高百香果皮果膠的得率[12]。由此可見，百香果皮果膠的得率可能與百香果皮結構破壞程度存在一定的相關性。

A：對照;B：水浴處理后;C：超聲處理后;D：微波處理后;E：超聲微波處理后。

A： CK; B： Treated by water; C： Treated by ultrasound; D： Treated by microwave; E： Treated by ultrasonic-microwave method.

圖4? 百香果皮渣掃描電鏡圖（1.00 k）

Fig. 4? Scanning electron microscope images of residual of peel of P. edulis （1.00 k）

3? 討論

目前對于百香果皮果膠的提取方法較多，主要以常見的水提和酸提醇沉為主，為加快細胞壁的破裂在此基礎上出現超聲波、微波、高壓及酶法輔助等提取方法，每種方法因品種、操作方法的不同各有優勢，得率也有所差異。本研究采用超聲微波輔助響應面法優化出百香果皮果膠最佳提取條件：pH?2.0，30 mL/g液料比在50 ℃溫度下先水浴60 min，再置于超聲微波協同萃取/反應儀（超聲功率50 W、微波功率600 W）處理8.0 min，此時得率為（12.14±0.06）%，酯化度為（66.46±0.41）%。張鳳仙等[21]采用酸提醇沉（0.75%檸檬酸，90～95?℃，2?h，固液比l∶4），得率為8.57%，甲氧基含量為9.8%（甲氧基含量≥7%為高酯果膠）。陳穎珊等[22]采用混合酸法（30%檸檬酸∶鹽酸= 2∶1，料液比45∶1，pH 1.5，65.5 ℃，1 h），得率為10.98%，酯化度為63.77%。與張鳳仙等[21]和陳穎珊等[22]相比，本研究的得率分別提高41.66%和10.57%。黃永春等[23-24]采用傳統酸提，得率為2.22%，甲氧基含量為10.28%，采用超聲波和微波輔助提取，得率分別為2.51%和2.60%，甲氧基含量為10.47%和10.39%。劉運花等[25]以復合酶法提取西番蓮果膠，得率為2.63%。與黃永春等[23-24]和劉運花等[25]的研究相比，本研究的得率分別提高了4～6倍。原因可能是采用超聲微波協同提取可在短時間內利用微波對百香果皮細胞結構的破壞力和微波的熱效應以及超聲波的機械和空化效應，增加細胞壁和細胞膜的通透性，增大介質的穿透力及分子的運動速度[13]，更有利于果膠充分且迅速溶出，進而大幅度提高了得率。此外，本研究采用原料預先浸泡（50 ℃，60 min），可利用水的作用將百香果皮細胞溶脹，降低果膠擴散到水中的阻力，亦有利于果膠的溶出[26]。進一步比較后可發現，黃永春等[23-24]和劉運花等[25]所用原料均為百香果鮮果皮，由于百香果鮮果皮中水分含量高達88%左右。由此可知同等質量條件下，百香果鮮體中果膠含量明顯低于干體的，從而造成得率差異極顯著。綜上，可知百香果品種、原料含水量、提取方法和提取條件等因素對香果皮果膠得率有極顯著影響，但都屬于高甲氧基果膠。

4? 結論

本研究在單因素實驗的基礎上，以百香果皮果膠的得率為響應值，對百香果皮果膠的提取參數進行響應面優化實驗，最終確定超聲微波輔助法的最佳工藝參數：液料比30 mL/g，pH 2.0，溫度50 ℃，水浴60 min，超聲功率50 W、微波功率600 W、超聲微波時間8.0 min，百香果皮果膠得率為（12.14±0.06）%，與相同參數條件下單一的水提、超聲及微波法提取相比，得率分別提高了47.33%、34.74%和23.50%，其酯化度在61.62%～66.46%之間，均為高酯化果膠。掃描電鏡結果顯示超聲微波協同法使百香果皮的結構變得更加細碎、多孔、疏松，更有利于果膠的溶出。同時超聲微波協同提取法操作簡便，結果可靠，穩定性好，而且具有高效、快速、節能、無污染等特性，可作為百香果皮果膠提取工藝進行推廣應用。

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