拮抗放線菌菌株FS-4發酵工藝篩選

段雅婕 梅志剛 孫德權 李偉明 龐振才 胡會剛

摘? 要：FS-4是1株對香蕉枯萎病菌有較好拮抗作用的放線菌。以高氏一號培養基為基礎，通過單因素和響應面實驗進行了相關優化，對FS-4菌株的發酵工藝進行篩選。結果表明：0.5%蛋白胨，2.4%蔗糖，0.05%的磷酸氫二鉀、氯化鈉和硫酸鎂，發酵溫度28?℃，初始pH為7為最佳培養基配方及最優發酵條件。發酵62 h后，發酵液中抑菌物質活性達到最高水平，對香蕉枯萎病菌的抑菌圈直徑達到27.1 mm。

關鍵詞：放線菌菌株FS-4;發酵工藝;響應面法

中圖分類號：Q949.748.5????? 文獻標識碼：A

Abstract： The screening of antagonistic bacteria from soil microorganisms in the areas with banana Fusarium wilt is of great practical significance for controlling this disease. In this report， a strain， designated FS-4， was isolated from healthy banana rhizosphere soil in the area affected by Fusarium wilt. Based on Gauses No. 1 synthetic medium， the optimization of medium， single factor experiments and response surface experiments were conducted to maximize the production of the antibacterial substances of actinomycete FS-4. The best fermentation medium and fermentation conditions were as follows： sucrose 2.4%， peptone 0.5%， K2HPO4 0.05%， NaCl 0.05%， MgSO4 0.05%， fermentation temperature 28 ℃， initial pH 7. Under the conditions， the inhibition zone diameter of actinomycete FS-4 fermentation filtrate reached 27.1 mm on the test plates of Bacillus subtilis after 62 h incubation

Keywords： actinomycetes FS-4; fermentation conditions; response surface method

由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）侵染引起的枯萎病是香蕉種植中的毀滅性病害，對相關產業的健康發展具有重要影響[1]。抗病育種、化學農藥、輪作等方法在對香蕉枯萎病的防治中均存在不同的缺陷，難以規模化推廣應用。利用包括拮抗微生物在內的生物防治方法具有安全、環保、經濟效益高等優點，是當前該類病害防治研究中的熱點[2]。FS-4是本團隊從香蕉枯萎病發病田土壤中分離篩選出的1株放線菌，其對香蕉枯萎病菌具有較好拮抗作用[3-4]。

本團隊采用16S rDNA 序列分析其放線菌為曼尼普爾鏈霉菌（Streptomyces manipurensis），命名為曼尼普爾鏈霉菌FS-4（Streptomyces manipurensis FS-4）[3-4]。采用國際鏈霉菌規劃中的標準培養基（1976），28?℃培養7～21 d，觀察FS-4菌株培養特征。結果發現：FS-4菌株能使硝酸鹽還原，淀粉水解，能產生H2S、黑色素、尿素酶和酪氨酸酶，但不能使明膠液化、牛奶胨化與凝固。生長pH范圍為5.0～10.0，最適生長pH為7.0。最適生長溫度為28～32?℃，不能生長在NaCl含量大于3%的培養基。FS-4菌株對香蕉枯萎病1號（Foc 1）和4號（Foc 4）小種均有拮抗作用，對香蕉枯萎病菌1號小種的拮抗性較弱，顯著低于香蕉枯萎病菌4號小種，2者的抑菌帶寬度分別為12.07和15.12 mm。

菌株FS-4在人工培養條件下生長緩慢，制約了相關研究工作的進行。響應面分析法通過研究響應輸出結果與影響因子之間的數學關聯模式，經由設計者在所關心的試驗區域內以系統的方式進行試驗，最終得到所設想的響應值和影響因子變化趨勢，是一類包含了數學應用、統計處理和試驗設計的分析工具[5]，近年來在微生物發酵工藝研究中得到廣泛應用。為更好地開展FS-4拮抗作用機理及其田間應用研究，本研究采用響應面分析法開展FS-4菌株的發酵工藝篩選研究。

1? 材料與方法

1.1? 材料

拮抗放線菌菌株FS-4和香蕉枯萎病菌菌株Foc 4由中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所提供。高氏1號培養基和營養肉湯培養基參照王小琴等[6]的方法制備，相關試劑均為國產分析純。

1.2? 方法

1.2.1? 菌株發酵和拮抗活性評價? 參照段雅婕等[3]和柯春亮等[4]的方法進行。

1.2.2? 液體發酵培養基及發酵條件的單因素分析[7-11]? 以高氏1號培養基為基礎，分別以不同碳源（葡萄糖、蔗糖、玉米粉、乳糖）代替基礎培養基中的碳源（可溶性淀粉）。制備無菌發酵濾液后，采用牛津杯法評價拮抗物質活性。獲得最佳碳源后，將含量調整為1%、2%、3%、4%和5%，篩選出最佳含量。在明確最佳碳源及其含量后，以0.1%的硫酸銨、硝酸鈉、酵母粉、蛋白胨代替原基礎培養基中硝酸鉀，篩選出最佳氮源。將最佳氮源含量調整為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，確定最佳含量。

將氯化鈉、磷酸氫二鉀和硫酸鎂含量分別調為0.025%、0.050%、0.075%、0.100%、0.125%，篩選出最佳含量。設置培養基初始pH為 5、6、7、8和9，發酵溫度為22、25、28、31和34?℃，發酵時間為48、72、96、120和144 h，分別篩選出最佳參數。

1.2.3? 響應面分析法優化發酵培養基及發酵條件? 在單因素實驗的基礎上，選取蔗糖、蛋白胨、時間作為考察因素，以抑菌圈大小為響應值，采用3因素3水平對放線菌FS-4最佳發酵條件進行響應面分析（表1）[12]。

1.3? 數據處理

利用Design-Expert軟件進行3因素3水平的Box-Behnken實驗設計。所有實驗均為3次重復，使用SPSS19.0軟件進行統計學方差分析。

2? 結果與分析

2.1? 單因素實驗結果

2.1.1? 碳源種類及含量對放線菌FS-4產抑菌物質的影響? 以高氏一號培養基為基礎進行碳源的優化[13]，分別以蔗糖、乳糖、玉米粉、葡萄糖、可溶性淀粉作為碳源。結果表明，以蔗糖為碳源的培養基，發酵液的抑菌圈直徑最大達到20.5 mm，表明蔗糖最有利于放線菌FS-4產生抑菌物質（圖1）。在對蔗糖5個不同濃度處理的評價中，發現含量為2%時，發酵液產生的抑菌物質活性最強（圖2）。

2.1.2? 氮源種類及濃度對放線菌FS-4產抑菌物質的影響? 以高氏1號培養基為基礎，進行了5種氮源的篩選[14-15]。以蛋白胨為碳源時，抑菌圈直徑最大，效果最好（圖3），而且當蛋白胨含量為0.4%時，發酵液的抑菌物質活性最高（圖4）。

不同小寫字母表示差異分析達到5%顯著水平。

2.1.3? 氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂含量對放線菌FS-4產抑菌物質的影響? 在高氏1號培養基的基礎上進行了無機鹽濃度的優化，結果表明，3種無機鹽的不同濃度對放線菌FS-4抑菌物質的活性影響不大（圖5）。

不同小寫字母表示差異分析達到5%顯著水平。

2.1.4? 初始pH、發酵溫度、時間對放線菌FS-4產抑菌物質的影響? 圖中抑菌圈的直徑反映發酵液中抑菌物質的活性。篩選結果表明，初始pH在6～8、發酵溫度在22～31?℃范圍內，無菌發酵液拮抗物質活性活性最高，而48 h為發酵最適時間（圖6，圖7和圖8）。

2.2? 響應面優化結果及分析

2.2.1? 響應面結果? 如表2所示，本研究對17個實驗點進行分析。其中，12個點是析因點，5個點（實驗號分別為1、5、8、10和17）用于計算實驗誤差的中心實驗點。

對回歸方程模型進行方差分析，結果如表3所示。回歸方程模型極顯著，表明模型建立可信。模型的決定系數為0.9604，表明3.96%的實驗數據不適合預測模型。模型的校正系數為0.9094，說明模型擬合程度良好，只有9.06%的實驗數據的變異性不能解釋。失擬項的P值是0.4386，不具有統計學差異，說明模型不需要引入更高次數的項。一次項A和C，二次項C2都達到極顯著水平，交互項AC，二次項A2都達到顯著水平。還可以得知3個因素對抑菌圈直徑大小的影響順序為：蛋白胨>蔗糖>時間。

2.2.3? 響應面的分析與優化[17-18]? 根據建立的回歸模型得到響應曲面圖（圖9）。當時間一定時，抑菌圈的直徑隨著蛋白胨和蔗糖含量的增加而變大，蛋白胨比蔗糖對抑菌圈直徑影響更大，兩者的交互作用不明顯。蔗糖含量在2.50%～3.00%，蛋白胨含量在0.45%～0.50%范圍內，抑菌圈的直徑達到最大（圖9）。

當蔗糖含量和時間一定時，抑菌圈的直徑與蛋白胨含量成正相關，而蔗糖和蛋白胨含量一定時，抑菌圈的直徑隨著時間的延長先增大后減小，兩者交互作用明顯。時間在56～64 h內，蛋白胨含量在0.45%～0.50%范圍內，抑菌圈的直徑達到最大（圖10）。

當蛋白胨含量和時間一定時，抑菌圈的直徑與蔗糖含量成正相關，但增長趨勢較緩。當蔗糖和蛋白胨含量一定時，抑菌圈的直徑隨著時間的延長先增大后減小，說明超過一定發酵時間后，發酵液中抑菌物質活性會降低，且蔗糖和蛋白胨交互作用不明顯。時間在56～64 h內，蛋白胨含量在2.50%～3.00%范圍內，抑菌圈的直徑達到最大（圖11）。

2.2.4? 放線菌FS-4發酵培養基及發酵條件的優化和可靠性驗證? 通過Design-Expert V8.0.6軟件分析得到最佳條件為：蛋白胨含量0.5%，蔗糖2.37%，時間62.04 h。在此條件下，抑菌圈的理論直徑為27.46 mm。為簡化實驗操作，將條件修正為蛋白胨濃度0.5%，蔗糖濃度2.4%，時間62 h。實際得到抑菌圈直徑27.1 mm，與預測理論值相近。因此，得出的最佳條件具有較好的實用價值。

3? 討論

抗菌活性物質通常作為拮抗放線菌發揮生物防治作用的物質基礎，其產量的高低影響著抑菌的實際效果[15， 19]。發酵是獲得大量微生物活性代謝產物的基礎，微生物代謝產物的類型和產量與其培養條件，如培養基中的碳源、氮源、pH等密切相關[20-21]，因此，探索出適宜的培養條件尤為關鍵。研究表明，不同培養基配方對菌株抑菌活性有較大影響[22-23]。程沁園等[24]研究的放線菌菌株WB-F以葡萄糖為碳源，黃豆粉為氮源時，單體積發酵液抑菌直徑提高了23.1%。朱宏建等[25]發現的放線菌菌株ND045在碳源為蔗糖、氮源為大豆粉時，菌株發酵濾液對辣椒尖孢炭疽病菌（Colletotrichum acutata）的抑菌率為35.2%。另外，發酵時間對放線菌FS-4產抑菌物質也會產生影響。在本研究中，由圖8可知24 h的發酵液里已有抑菌物質，當發酵48 h后，抑菌圈直徑不再增加，說明放線菌FS-4基本停止產生抑菌物質或者抑菌物質的活性下降。

發酵工藝中的每一步、每個環節都至關重要。傳統的正交試驗設計、全因子試驗設計等手段優化微生物發酵工藝，實驗工作量較大，結果也不全面。而響應面法能很好地對影響發酵工藝過程中的培養基、培養條件等進行優化和評價[26]。本研究采用響應面實驗進行發酵條件的優化，與優化前相比，菌株FS-4抑菌直徑增加了26.1%。不同發酵條件對菌株發酵液抑菌活性有一定影響。本研究得到菌株FS-4最優發酵條件為：蛋白胨0.5%，蔗糖2.4%，時間62 h，發酵溫度28?℃，發酵pH為7，磷酸氫二鉀、氯化鈉和硫酸鎂為0.05%。這與莫坤聯[27]從抗香蕉枯萎病菌放線菌BWL58及BWL15-4菌株的最優發酵條件存在一定差異，其原因可能是不同菌株對于發酵過程中各理化因素需求不同的表現，也可能是生理代謝途徑因菌種差異的體現。

微生物發酵是個動態的生物學過程，培養基中各養分含量、pH、容氧量和產物量一直處于不斷變化，不同因素的變化會對發酵產物的種類和產量均有較大的影響[27]。本研究僅考慮了發酵前的培養基狀態和培養條件，未對發酵過程各因素進行動態監控，在后續的研究中，應采用生物化學分子生物學等方法對目標菌株的代謝動態過程進行深入研究，探討培養基的各養分含量與目標活性物質產量及培養條件之間的關系，進而提高目標活性物質的產率。

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