MCP-1、VEGF 在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其相關(guān)性

王宏宇，韋 燾，王進(jìn)昆，楊智勇，王偉民，丁 鵬

（1）吉林省神經(jīng)精神病醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林四平 136000；2）昆明醫(yī)科大學(xué)圖書(shū)館，云南昆明 650500；3）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，云南昆明 650032）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源于上皮細(xì)胞，是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)惡性腫瘤，呈侵襲性生長(zhǎng)，具有術(shù)后復(fù)發(fā)快，死亡率高等特點(diǎn)，總體治療效果不佳，直至目前仍為神經(jīng)外科最為難治的腫瘤之一[1-2]。分子水平差異的內(nèi)在腫瘤生物學(xué)特性，在膠質(zhì)瘤治療中至關(guān)重要[3]。MCP-1 即單核細(xì)胞趨化蛋白-1（Monocyte Chemoattractant Protein-1）是具有趨化、活化單核巨噬細(xì)胞的一類(lèi)趨化因子，屬趨化因子CC 類(lèi)家族，是其家族中最先被克隆的趨化因子，近年通過(guò)對(duì)MCP-1 深入研究、對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能已有新的認(rèn)識(shí)[4]發(fā)現(xiàn)其在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中作用關(guān)鍵。VEGF 即血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial cell growth factor），是一類(lèi)血小板源性蛋白[5]，以旁分泌方式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖并誘導(dǎo)血管生成，并被認(rèn)為是已知的最強(qiáng)烈的刺激血管形成的物質(zhì)。在多種惡性腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)其大量表達(dá)，在腫瘤中呈高表達(dá)的VEGF能與其相應(yīng)的受體特異性結(jié)合，繼而誘發(fā)腫瘤血管新生；而持續(xù)、廣泛的新生血管可提供養(yǎng)分給腫瘤細(xì)胞。膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，涉及腫瘤細(xì)胞與宿主之間錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系，受到許多細(xì)胞因子的調(diào)控。筆者通過(guò)免疫組化的方法在對(duì)人腦膠質(zhì)瘤中MCP-1 與VEGF 的表達(dá)水平與病理學(xué)分級(jí)關(guān)系上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分析兩者表達(dá)與病理級(jí)別的關(guān)系，探討其是否具有協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及分類(lèi)

選取適合本研究的膠質(zhì)瘤術(shù)后病理存檔蠟塊共44 例，Ⅰ-Ⅳ級(jí)各11 例。其分類(lèi)及分級(jí)診斷標(biāo)準(zhǔn)照1993 年WHO 的標(biāo)準(zhǔn)[6]，并再次經(jīng)病理證實(shí)。均排除合并其它器官腫瘤、伴風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病的患者。

1.2 主要試劑

MCP-1 和VEGF 單克隆抗體、鏈酶親和素-生物素-過(guò)氧化物酶附合物免疫組化試劑盒和DAB 顯色試劑盒分別購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司、北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組化染色：采用免疫組化法，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)標(biāo)準(zhǔn)。MCP-1 抗體的工作濃度為1：60；VEGF 為即用型試劑，PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 陽(yáng)性結(jié)果判定

陽(yáng)性反應(yīng)判斷由2 位病理主治醫(yī)師共同閱片得出。MCP-1 主要表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中，細(xì)胞核中無(wú)表達(dá)；VEGF 主要位于細(xì)胞膜上，細(xì)胞漿中也有表達(dá)，陰性對(duì)照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，無(wú)棕黃色反應(yīng)顆粒。隨機(jī)選擇高倍鏡（HP:X400）下5個(gè)視野，合并計(jì)算陽(yáng)性百分比。鏡下平均每個(gè)視野的細(xì)胞膜（漿）呈陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)≥10%為陽(yáng)性，無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)或陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性。

1.5 圖像分析

實(shí)驗(yàn)所得圖片采用專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件Image-ProPlus6.0 分析處理，免疫反應(yīng)的標(biāo)記強(qiáng)度均用矯正IOD 值（CIOD 值）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 軟件完成。統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用卡方檢驗(yàn)及Spearman 相關(guān)分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCP-1 與VEGF 在各病理級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

MCP-1 與VEGF 的表達(dá)率在病理級(jí)別高的標(biāo)本中高于病理級(jí)別低的標(biāo)本，見(jiàn)圖1、圖2。

2.2 MCP-1 與VEGF 在各病理級(jí)別膠質(zhì)瘤中的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

MCP-1 與VEGF 在病理Ⅲ～Ⅳ級(jí)中的表達(dá)高于Ⅰ-Ⅱ級(jí)（P ＜0.05），見(jiàn)表1。

2.3 MCP-1 與VEGF 在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的相關(guān)性

MCP-1 與VEGF 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，前者CIOD 值的中位數(shù)和上下四分位數(shù)為19.50[6.00,33.00]，后者CIOD 值為13.50[5.25,24.50]。經(jīng)過(guò)Spearman 相關(guān)分析，兩者呈正相關(guān)，r=0.734，P=0.001，P ＜0.05。

3 討論

新生血管是實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)的必要條件。血管生成是不同生長(zhǎng)因子程序化調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程[6]。VEGF是血管新生的關(guān)鍵因子之一[7]。并被認(rèn)為其在已知的刺激血管形成的物質(zhì)中最為強(qiáng)烈。VEGF 首先從瘤細(xì)胞的分泌物中分離出，并通過(guò)旁分泌形式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)血管生成。在全身多系統(tǒng)的惡性腫瘤細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)VEGF 大量表達(dá)，大量表達(dá)的VEGF 在與相應(yīng)的受體特異性結(jié)合后，促進(jìn)腫瘤血管生成；已有研究證實(shí)膠質(zhì)瘤最常見(jiàn)的侵襲途徑是沿血管基底膜侵襲，由VEGF 介導(dǎo)、增加血管通透性進(jìn)一步促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。間接證明了在膠質(zhì)瘤血管新生、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖中均有VEGF 的參與并為腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移提供條件[8-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)在人腦膠質(zhì)瘤中VEGF 大量表達(dá)，且表達(dá)陽(yáng)性率隨病理級(jí)別的增高而表達(dá)增強(qiáng)。

圖1 MCP-1 在Ⅰ-Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（SP 法×100）Fig.1 Expression of MCP-1 in glioma Ⅰ-Ⅳ（IHC:SP×100）

圖2 VEGF 在Ⅰ-Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（SP 法×100）Fig.2 Expression of VEGF in glioma Ⅰ-Ⅳ（IHC:SP×100）

表1 MCP-1 與VEGF 在各級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平［n（%）］Tab.1 MCP-1 and VEGF expression in gliomas with all grades ［n（%）］

隨著對(duì)MCP-1 結(jié)構(gòu)、功能的不斷研究，發(fā)現(xiàn)其在口腔癌[10]、鼻咽癌[11]、胃癌[12]、結(jié)直腸癌[13]、肺癌[14]等研究中與腫瘤的惡性程度、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等方面密切相關(guān)。筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與大多數(shù)惡性腫瘤一致，膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別越高，MCP-1 表達(dá)越豐富。

在人腦膠質(zhì)瘤中聯(lián)合檢測(cè)MCP-1 與VEGF 的相關(guān)性研究目前較少見(jiàn)諸報(bào)到。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)在人腦膠質(zhì)瘤中MCP-1、VEGF 的表達(dá)水平并得出兩者之間存在著正相協(xié)同關(guān)系結(jié)論，即MCP-1 與VEGF 在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)均隨病理級(jí)別增高而表達(dá)增強(qiáng)。

有學(xué)者研究表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-association macrophages，TAMs）通 過(guò) 分 泌VEGF 等多種促血管生成因子促進(jìn)血管的新生[15]。在膠質(zhì)瘤中，MCP-1 趨化巨噬細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織中將其誘導(dǎo)分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，并被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞趨化募集的強(qiáng)烈趨化因子。通過(guò)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞間接促進(jìn)腫瘤血管的生成[16-17]也已經(jīng)被大量研究所證實(shí)。Koga 等[18]研究指出抑制MCP-1 作用，可抑制TAMs 募集，間接阻滯黑色素瘤血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。這些研究說(shuō)明MCP-1 可通過(guò)抑制TAMs 趨化募集間接抑制腫瘤血管生成。Futagami等[19]發(fā)現(xiàn)MCP-1 通過(guò)上調(diào)環(huán)氧化酶-2 而促進(jìn)VEGF 的生成。所以MCP-1 能在多種機(jī)制中通過(guò)間接途徑促進(jìn)VEGF 的生成而誘導(dǎo)腫瘤組織的大量血管新生；抑制MCP-1/CCR2 軸能間接抑制腫瘤的增殖也被許多實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)。本研究聯(lián)合檢測(cè)MCP-1、VEGF 蛋白的表達(dá)量并分析得出兩者之間存在著正相協(xié)同關(guān)系是對(duì)MCP-1/CCR2 軸能間接促進(jìn)VEGF 生成即血管新生的很好印證，這也為本課題繼續(xù)深入研究MCP-1/CCR2 軸是否存在其它間接促進(jìn)VEGF 生成的機(jī)制或直接機(jī)制提供后續(xù)研究可能。