外周血CTCs 與前列腺癌臨床特征的相關性

李 琿，平秦榕，史云強，王春暉，楊 洋，胡禮炳，畢曉方，李 健，鐘一鳴

（昆明市延安醫院泌尿外科，云南昆明 650051）

前列腺癌是老年男性泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，其發病率居泌尿系腫瘤第1 位，居男性全身惡性腫瘤第2 位[1]。前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）目前臨床常用的篩查、監測前列腺癌的血液學指標，但由于PSA 是組織特異性抗原而非腫瘤特異性抗原，故具有一定的假陽性率，尤其對于PSA 值為4～10 ng/mL 的患者，前列腺癌檢出率僅為25%左右[2-3]。尋找敏感性高、特異性強、無創、檢測成本低、簡便易行的前列腺癌篩查、監測的方法已成為研究的熱點。循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）檢測是一種采集外周血，檢測外周循環血中腫瘤細胞的數量，進而對腫瘤進行篩查、監測的方法，具有較好的臨床應用前景。本研究通過檢測前列腺癌患者CTCs 數量，分析CTCs 檢測與前列腺癌臨床特征的相關性，旨在探討CTCs 檢測在前列腺癌篩查、監測中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析2016 年1 月至2018 年12 月期間昆明醫科大學附屬延安醫院泌尿外科收治的110 例前列腺疾病（前列腺增生或前列腺癌）患者的臨床資料。按診斷不同分為兩組，其中57 例前列腺癌患者作為研究組，所有患者均經B 超引導下穿刺活檢或（和）術后病理確診為前列腺癌，腫瘤均為初次發現，年齡63～79 歲，平均（69.5±7.7）歲；53 例前列腺增生患者作為對照組，術后病檢均確診為前列腺增生，年齡66～81 歲，平均（71.2±5.4）歲。本研究報醫院科研部和倫理委員會獲得批準，檢測前所有患者簽署知情同意書。兩組年齡差異無統計學意義（t=-1.3313，P=0.0929）。

有以下情況者排除[4-6]：（1）既往有腫瘤病史或合并其他系統腫瘤病史者；（2）合并急慢性前列腺炎者；（3）合并嚴重的呼吸、循環、血液系統疾病者；（4）檢測前3 月內口服抗凝藥物、激素類藥物或有創傷、手術史者。

1.2 檢測方法

醫用抗凝采血管（抗凝劑為EDTA·K2/EDTA·Na2）采集患者外周血4～6 mL，4℃冷藏、運送，48 h 內檢測。利用免疫磁球分離（Anti-EpCAM）及熒光染色法對外周血中的CTC 進行檢測和計數。采血時機均為手術或內分泌治療、放化療前。

1.2.1 CTCs 的分離（1）取3.75 mL 抗凝血液，加入等體積的清洗液進行稀釋后備用，50 mL 離心管中加入7.5 mL 樣本密度分離液，將稀釋后的血液小心平鋪到分離液液面上方，注意保持兩界面的清晰；（2）室溫下，低速離心機水平轉子2 000 rpm，離心20 min；（3）離心后出現明顯的4 層分層，吸棄最上層稀釋血漿層，小心取第二層白膜層置于15 mL 離心管中，加入2 mL 清洗液（滬浦械備20160087 號）重懸細胞；（4）加入Anti-EpCAM 免疫納米磁球30 μL，室溫孵育30 min，每5 min 混勻一次；（5）孵育結束后將離心管插入多功能磁分離架上靜置15 min，吸棄上清液后將離心管自多功能磁分離架上取出。

1.2.2 細胞固定（1）取400 μL 組織固定液重懸樣品，室溫放置10 min；（2）向離心管中加入1mL 清洗液，將離心管插入多功能磁分離架上靜置15 min，吸棄上清液后將離心管自多功能磁分離架上取出。

1.2.3 細胞染色（1）加30 μL 染色液A（Anti-CK8，18，19-FITC 熒光抗體）、20 μL 染色液B（DAPI）、10 μL 染色液C（Anti-CD45-PE 熒光抗體），混勻后避光染色15 min；（2）向離心管中加入1 mL 清洗液，將離心管插入多功能磁分離架上靜置15 min，吸棄上清液后將離心管自多功能磁分離架上取出；（3）向離心管中加入1 mL 清洗液，將離心管插入多功能磁分離架上靜置15 min，吸棄上清液后將離心管自多功能磁分離架上取出。

1.2.4 CTCs 的計數 向離心管中加入30 μL 清洗液重懸磁球-細胞混合物，混勻后將溶液均勻涂于防脫載玻片上，Leica DM4 B&DM6 B Life Science Research 自動掃描顯微鏡和圖像分析系統，按照相應程序進行CTCs 計數與統計。

1.2.5 判定標準（1）當細胞核DAPI 染色（藍色熒光）為陽性，Anti-CK8，18，19-FITC（綠色熒光）為陽性、細胞大小＞8 μm，可判斷為循環腫瘤細胞；（2）熒光符合循環腫瘤細胞判斷標準，但其大小＜8 μm 時判為陰性；（3）熒光及大小符合上述第1 條要求，但其明顯不具有細胞形態時判為陰性；（4）CTCs 陽性標準：外周血中CTCs≥5個/3.75 m 血樣。

1.3 觀察指標

統計并分析研究組與對照組CTCs 陽性率的差異。根據CTCs 計數結果，將研究組57 例進一步分為CTCs 陽性組和CTCs 陰性組，對比2 組PSA、Gleason 評分、病理分期≥T3a 發生率、骨轉移發生率等指標的差異。

1.4 統計學處理

采用SPSS 統計學軟件對數據進行統計分析。所有計量資料符合正態分布，以（）表示，2組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗；計數資料以例（%）表示，2 組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究組與對照組CTCs 計數結果比較

免疫磁球分離及熒光染色法處理后可見CD45-、DAPI+、細胞角蛋白19+的CTCs（藍色熒光為細胞核DAPI 染色陽性；綠色熒光為Anti-CK19-FITC 陽性），見圖1。CTCs 計數顯示，研究組CTCs 平均數量[（7.4±1.5）個]顯著高于對照組[（2.1±0.9）個]，差異具有統計學意義（t=22.2616，P＜0.0001）。研究組CTCs 陽性率61.4%（35/57）顯著高于對照組5.7%（3/53），差異具有統計學意義（χ2=35.3157，P＜0.0001）見圖1。

圖1 CTCs 陽性（CD45-、DAPI+、Anti-CK19-FITC+）Fit.1 CTCs positive（CD45-，DAPI+，Anti-CK19-FITC+）

2.2 CTCs 陽性組與陰性組比較

根據CTCs 計數結果將研究組57 例前列腺癌分為CTCs 陽性組35 例（CTCs≥5 個/3.75 m）和CTCs 陰性組22 例（CTCs＜5 個/3.75 m）。CTCs 陽性組PSA 值[（35.4±15.7）ng/mL]高于CTCs 陰性組[（17.5±10.6）ng/mL]；CTCs 陽性組Gleason 評分[（8.1±1.3）]高于CTCs 陰性組[（7.2±1.1）]；CTCs 陽性組骨轉移發生率[34.3%（12/35）]高于CTCs 陰性組[9.1%（2/22）]，差異具有統計學意義（P＜0.05）。CTCs 陽性組的病理分期≥T3a 發生率[29.2%（7/24）]低于CTCs 陰性組[30.3%（10/33）]大于CTCs 陰性組，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 CTCs 陽性組與陰性組比較Tab.1 Comparison of CTCs between positive group and negative group

3 討論

近年來，隨著我國人口老齡化的加劇，以及生活方式和飲食結構的變化，我國前列腺癌的發病率呈快速增長趨勢，70 歲以上老年男性的前列腺癌發病率已躍居男性泌尿生殖系腫瘤發病率第1位，對老年男性的健康造成了極大的威脅[4]。由于前列腺癌具有發病隱匿、早期診斷率低的特點，大部分患者就診時已進展至中晚期，治療難度大、成本高，嚴重危害男性的健康。腫瘤標志物的研究給前列腺癌的早期診斷帶來了希望，有些檢測腫瘤標記物的技術已經用于臨床。PSA 是目前唯一公認的可用于前列腺癌篩查、早期診斷的前列腺癌標志物，但易受炎癥、射精、直腸指診和導尿操作的影響，而出現假陽性。

在腫瘤的發生發展過程中，部分腫瘤細胞脫落后進入外周血，隨血液循環遷移、侵襲，進而為轉移病灶的形成提供了基礎。循環腫瘤細胞CTCs 是指從原發性或繼發性腫瘤病灶脫落進入血液循環的腫瘤細胞，與原發腫瘤細胞有類似的抗原和遺傳特性[5]。大量研究顯示[6]，CTCs 檢測具有非侵入性和實時監測的優點，有利于早期發現復發和轉移病灶，可用于篩選進展風險較高的患者，以便及早采取針對性治療。目前對CTCs 的檢測分析過程主要包括富集、分選、鑒定和分析等過程，相關技術主要包括免疫磁珠濃集、密度梯度離心、過濾分離、RT－PCR、免疫學方法、流式細胞分析、CTCs 芯片等。

有研究表明，檢測前列腺癌CTCs 的技術敏感性有限，但有很高的特異性，并且CTCs 數量與前列腺癌的分級和臨床分期顯著相關[7]。據文獻報道[8-9]，CTCs 計數可作為對已發生轉移的前列腺癌患者判斷療效和預后的指標。美國食品藥品監督管理局（FDA）已經批準將CTCs 計數作為轉移性乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌的預后評價指標[10]。但由于外周血中的CTCs 相當稀少，血液中約每106～107個白細可能僅有1 個CTCs[11]。因此，CTCs 的檢測需要細胞富集、結合細胞表面及內部標志物的多種技術。此外，由于腫瘤存在異質性，腫瘤細胞的特性和標志物也不盡相同，這就給CTCs 的捕獲及標記帶來較大的困難。因此，有必要進一步開展CTCs 研究，通過CTCs 檢測技術的改進和設備的更新來進一步提高前列腺癌篩查、監測的準確性。

隨著近年來分子生物學技術的不斷發展，CTCs 富集和檢測技術取得突破性進展，CTCs 檢測的應用價值逐漸受到關注。本研究采用Cell Identify CTCs 檢測試劑盒對前列腺癌CTCs 進行分離、富集、固定、染色和計數，Anti-EpCAM免疫納米磁球表面的抗體能與前列腺癌患者外周血中的CTCs 表面EpCAM 抗原發生特異性的結合，通過磁分離技術可實現CTCs 的分離和富集。在免疫磁球完成了對CTCs 的分離和富集后，添加熒光試劑以識別并對CTCs 計數。將樣本、試劑混合染色后，經熒光顯微鏡觀察進行鑒定，將具有Ep-CAM+、DAPI+、細胞角蛋白8、18 及/19+的細胞歸類為前列腺癌CTCs，從而實現對腫瘤患者外周血中的CTCs 的計數。研究結果顯示，研究組CTCs 平均數量（7.4±1.5）個顯著高于對照組（2.1±0.9）個，研 究 組CTCs 陽 性 率61.4%（35/57）顯著高于對照組5.7%（3/53）（P ＜0.05）。表明該方法檢測前列腺癌患者CTCs 具有較好的可行性和有效性，CTCs 數量與前列腺癌的發病風險呈正相關性，前列腺癌患者的CTCs 陽性率顯著高于良性前列腺增生，CTCs 陽性可作為篩查、監測前列腺癌的一項輔助依據。此外，CTCs 陽性組患者PSA 值[（35.4±15.7）ng/mL 與（17.5±10.6）ng/mL]、Gleason 評 分[（8.1 ±1.3）與（7.2±1.1）]和骨轉移發生率[34.3%（12/35）與9.1%（2/22）]均顯著高于CTCs 陰性組（P ＜0.05）。表明CTCs 陽性與前列腺癌PSA 值、Gleason 評分和骨轉移發生率有明顯相關性，在前列腺癌輔助診斷、療效監測和預后風險評估中具有較好的臨床價值。

盡管目前尚無一種檢測方法能完全替代PSA聯合DRE、病理學活檢在前列腺癌篩查和診斷中的作用，但多種檢測技術的聯合應用有望為前列腺癌的早期診斷、復發和轉移監測帶來新的突破。CTCs 檢測作為一種新型的體液活檢技術，具有簡便、無創、可靠的優點，可作為一項輔助診斷技術應用于前列腺癌的篩查和病情監測、預后風險評估，具有較好的潛在臨床應用價值。