向日葵盤精油的化學成分及抗氧化活性

何昶毅， 高瀟涵， 李澤文， 劉玲玲， 孫彤彤， 陳小強,3*

(1.東北林業大學 生命科學學院， 黑龍江 哈爾濱 150040； 2.東北林業大學 化學化工與資源利用學院，黑龍江 哈爾濱 150040； 3.西藏農牧學院 資源與環境學院， 西藏 林芝 860000)

向日葵(HelianthusannuusL.)為菊科(Compositae)向日葵屬(Helianthus)一年生草本植物，又名丈菊，原產北美，我國各地均有栽培。通過人工培育，向日葵頭狀花序(葵盤)的大小、色澤產生許多變異，可供藥用，也可作飼料及工業原料[1-2]。研究表明向日葵盤含有果膠[3-4]、酚類[5]、黃酮類[6]、多糖[7]、綠原酸[8]等多種生物活性成分，對心血管系統、高尿酸血癥等多種慢性疾病具有輔助治療作用[2,5]。向日葵盤作為食用或油用葵花籽生產過程中的主要副產物，我國每年產量約為8×105～10×105噸[5]，但多被當作飼料、燒柴甚至被廢棄，不僅使得資源浪費而且造成環境污染。精油是從植物中提取的多種揮發性物質組成的液體混合物，抗氧化活性是其重要的生物活性之一[9]。盡管已有對不同產地和生長期的向日葵盤精油的化學成分研究報道[10-12]，但對于向日葵采收后的葵盤精油成分及其體外抗氧化活性的研究未見報道。因此，本研究采用水蒸氣蒸餾法提取葵花籽采收后的向日葵盤精油，采用GC-MS法對其化學成分進行分析，并對精油的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力進行評價，以期為向日葵盤的綜合利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

向日葵盤(葵花籽采收后)于2018年9月采自黑龍江省蘭西縣，經東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室鑒定為向日葵(HelianthusannuusL.)的葵盤。C8～C20正構烷烴標準品、 2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基(DPPH)、 2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉- 6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、二丁基羥基甲苯(BHT)，美國Sigma-Aldrich公司；過硫酸鉀、甲醇等其他試劑均為分析純。

FW100高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；HP 6890/5973NMSD氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent Technologies公司；Infinite M200酶標儀，瑞士Tecan Group公司；752N紫外-可見分光光度計，上海精科實業有限公司。

1.2 向日葵盤精油的提取

將室溫干燥至質量恒定的向日葵盤進行粉碎并過0.90 mm篩。準確稱取100.0 g向日葵盤粉置于圓底燒瓶中，加入少許沸石和1 000 mL超純水，采用水蒸氣蒸餾法提取向日葵盤精油5 h，使用無水硫酸鈉對得到的精油進行干燥處理，-20 ℃儲存，待測備用。

1.3 精油的GC-MS分析

GC條件：HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣，載氣流量為1.0 mL/min，進樣量為0.02 μL，進樣口溫度280 ℃，分流比10 ∶1。程序升溫：從50 ℃開始，以5 ℃/min升溫到230 ℃，再以8 ℃/min升溫到280 ℃，保持5 min。MS條件：EI源，電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，溶劑延遲3.0 min，掃描范圍(m/z)5～400。檢索譜庫：NIST 02。最后用峰面積計算各成分的GC含量。

1.4 精油的抗氧化活性測定

1.4.1DPPH自由基清除能力 采用微板法測定精油的DPPH自由基清除能力[13]。配制系列質量濃度(0.062 5、 0.125、 0.25、 0.5和1.0 g/L)的精油樣品溶液，取樣品溶液20 μL加入96孔板中，再加入0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液180 μL，混勻，置于酶標儀中室溫避光孵化30 min，于517 nm處測定吸光度(A樣品+DPPH·)。以甲醇代替樣品溶液，同法測得吸光度(A空白)。取樣品溶液20 μL加入96孔板中，再加入甲醇180 μL，置于酶標儀中室溫避光孵化30 min，于517 nm 處測定吸光度(A樣品)。以BHT為陽性對照，進行3組平行試驗，取平均值。DPPH自由基清除率(ηDPPH·)按式(1)計算：

ηDPPH·=(1-A樣品+DPPH·+A樣品)/(ADPPH·-A空白)×100%

(1)

根據精油質量濃度和DPPH自由基清除率，計算精油樣品處理DPPH自由基清除率為50%時對應的半數有效濃度(EC50值)。

1.4.2ABTS自由基清除能力 依據文獻[14]測定精油的ABTS自由基清除能力。取7 mmol/L ABTS儲備液與2.45 mmol/L過硫酸鉀儲備液按體積比1 ∶0.5混合均勻，室溫避光靜置16 h，得到ABTS自由基母液。ABTS自由基母液用乙醇稀釋配制成工作液，使其在波長734 nm處吸光度為0.70±0.02。在2.40 mL ABTS工作液中加入0.1 mL系列質量濃度(0.05、 0.1、 0.2、 0.4和0.8 g/L)的精油樣品溶液，混勻，30 ℃ 暗反應6 min，于波長734 nm處測定吸光度(A樣品)，同時測定空白對照(ABTS溶液)在734 nm下的吸光度(A空白)。以BHT為陽性對照，進行3組平行試驗取平均值。ABTS自由基清除率(ηABTS+·)按式(2)計算：

ηABTS+·=(A空白-A樣品)/A空白×100%

(2)

根據精油質量濃度和自由基清除率，計算精油樣品處理ABTS自由基清除率為50%時對應的半數有效濃度(EC50值)。

2 結果與討論

2.1 向日葵盤精油的化學成分分析

GC-MS法分析了向日葵盤精油樣品的組成及其GC含量，總離子流色譜圖見圖1。利用C8～C20正構烷烴和保留時間計算精油各組分的保留指數(IR)，結合NIST質譜庫和文獻中各組分的保留指數對化合物進行鑒定，結果見表1。

圖1 向日葵盤精油的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of the essential oil from H. annuus heads

由表1可知，向日葵盤精油中共鑒定出49種化合物，占精油總量的91.16%。其中α-蒎烯(28.22%)、檸檬烯(6.55%)、α-蛇麻烯(4.99%)、反式-β-金合歡烯(3.58%)和莰烯(3.39%)為精油的主要成分,占精油總量的46.73%。鑒定成分中單萜類化合物占44.26%，氧化單萜類化合物占10.92%，倍半萜類化合物占20.78%，氧化倍半萜類化合物占14.70%，其他類化合物占0.50%。

張玲玲等[10]對廣東產新鮮向日葵花盤的揮發油成分進行了GC-MS分析，共鑒定出29種化合物，其中含量較高的成分為α-蒎烯(21.95%)、檜烯(15.66%)、β-蒎烯(4.03%)、白菖油萜(3.29%)和大根香葉烯D(3.62%)。索金玲[11]利用氣質聯用技術對新疆產向日葵花盤揮發油進行研究，從花期揮發油中鑒定出39種成分，主要成分有α-松萜(55.24%)、β-水芹烯(5.77%)、白菖油萜(5.91%)、4-松油醇(3.19%)；成熟期揮發油中鑒定出36種成分，主要成分有α-松萜(41.78%)、白菖油萜(14.22%)、β-紅沒藥烯(2.97%)，其中17種化合物為二者共有，以α-松萜(α-蒎烯)、白菖油萜為主。Ceccarini等[12]對處于花期的2種意大利產向日葵的葉和花盤精油進行了研究，其中花盤精油的主要成分有α-蒎烯(57.1%～60.0%)、檜烯(19.8%～20.2%)、β-蒎烯(6.8%～7.2%)、檸檬烯(5.1%～6.9%)、大根香葉烯D(6.0%～6.3%)、乙酸異龍腦酯(5.2%～6.0%)、莰烯(4.9%～5.2%)。與上述文獻對比，本研究中α-蒎烯仍為精油的最大量成分，說明從花期至采收后期，該成分在向日葵盤中的含量較為豐富且穩定。相較文獻[11]成熟期的向日葵花盤精油成分，采收后鑒定出的相同化合物且GC含量大于1%的還有莰烯。此外，由于實驗原料產地、采收季節、提取方法及分析條件等不盡相同，不同研究結果間也存在一定差異。

2.2 向日葵盤精油的體外抗氧化活性

表1 向日葵盤精油的化學成分

合計 total91.16

圖2 向日葵盤精油對DPPH和ABTS自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effects of essential oil from sunflower head on DPPH· and ABTS·

向日葵盤精油與陽性對照BHT對DPPH自由基清除活性的半數有效濃度(EC50)值分別為(0.47±0.12) g/L和(8.21±0.15) mg/L。

Mehmood等[5]研究了向日葵盤乙醇提取物的DPPH自由基清除作用，結果表明：在5 ∶1～50 ∶1的液固比條件下，得到的每克提取物針對DPPH自由基的抗氧化活性相當于657.17～942.02 μg Trolox。馬雪梅等[15]研究結果表明：向日葵盤果膠<10 ku級分對DPPH自由基的清除效果最好，樣品質量濃度為6.4 g/L時最大清除率達92.78%。在食品工業中，部分植物精油因具有良好的抗氧化作用而被認為是人工合成抗氧化劑的優良替代品[16]。由本研究結果可見，采收后向日葵盤精油對DPPH自由基具有一定清除能力，但其EC50值為(0.47±0.12) g/L大于陽性對照BHT的(8.21±0.15) mg/L。酚類化合物被認為是精油抗氧化活性的物質基礎之一[17]。向日葵盤精油主要成分為α-蒎烯(28.22%)、檸檬烯(6.55%)、α-蛇麻烯(4.99%)等非酚類化合物，這可能是其抗氧化活性較弱的原因[18]。需要指出的是，也有研究顯示，γ-萜品烯等非酚類成分含量較高的精油也具有較好的體外抗氧化活性，但相關機制尚不清晰[19]。

ABTS法較DPPH法適用于更多類型的抗氧化活性物質篩選[20]，且ABTS法對親脂性和親水性抗氧化物均適用[21]。雖然ABTS法和DPPH法具有相同的反應機理，但ABTS法得到的EC50值要小于DPPH法，這是因為精油中抗氧化活性成分與DPPH和ABTS反應的化學計量比不同，位阻因素和側鏈雙鍵的諧振作用亦使DPPH自由基更穩定[22]。向日葵盤乙醇提取物的ABTS自由基清除作用研究發現，在5 ∶1～50 ∶1的液固比條件下，得到的每克提取物針對ABTS自由基的抗氧化活性相當于773.35～902.02 μg Trolox[5]。向日葵盤精油對ABTS自由基清除作用尚未見文獻報道，本研究發現二者呈現明顯的質量濃度依賴性，質量濃度為0.8 g/L時精油的ABTS自由基清除率為89.70%，但其EC50值為(0.30±0.08) g/L仍大于陽性對照BHT的(6.16±0.13) mg/L，與DPPH法的研究結果一致。

3 結 論

對采收后向日葵盤精油的成分及其體外抗氧化活性進行了研究。通過GC-MS分析，共鑒定出49種化學成分(占精油總量91.16%)，其主要成分有α-蒎烯(28.22%)、檸檬烯(6.55%)、α-蛇麻烯(4.99%)、反式-β-金合歡烯(3.58%)和莰烯(3.39%)。體外抗氧化活性研究發現：向日葵盤精油具有一定的體外抗氧化活性，其清除DPPH、ABTS自由基的半數有效濃度(EC50)值分別為0.47、 0.30 g/L，大于陽性對照BHT，具體活性組分仍有待進一步研究。