抗白粉病基因RPW8的抗性作用研究進展

羅昌國，王三紅，袁啟鳳，鄭 偉，宋 莎

(1.貴州省農業科學院 果樹科學研究所，貴州 貴陽 550006； 2.南京農業大學 園藝學院，江蘇 南京 210095)

1997年在擬南芥(Arabidopsisthaliana)上發現3個抗白粉病﹝Erysiphespp.(Golovinomycesspp.)﹞的位點RPW(RESISTANCE TO POWDERY MILDEW)6/7/8，其中RPW8.1(GenBank ID：AF273059)和RPW8.2(AF273059)基因是擬南芥Ms-0生態型2個緊密連鎖的白粉病抗性基因，于2001被成功克隆，并具有抗白粉病的功能。RPW8在不同生態型的擬南芥中存在被同源基因取代的現象，即便基因不被取代也可能在功能方面存在一定差異。在來自全球各地的不同生態型的擬南芥中，RPW8.1和RPW8.2基因主要存在于抗白粉病擬南芥Ms-0、Kas-1、Wa-1、Ei-5、Nw-0等5個生態型中；在感病擬南芥Col-0、Fr-3、Is-1、Nie-0、Sg-2等生態型中則缺乏RPW8.1和RPW8.2基因，取而代之的是HR4；而Bu-06、Is-0、K1-0生態型中具備RPW8.1和RPW8.2基因，但卻表現出感病的性狀。在擬南芥中，RPW8的同源基因還有HR1(Tair ID：At3g50450)、HR2(At3g50460)和HR3(At3g50470)。RPW8基因在不同種類植物中，甚至同種不同生態型中，其基因序列和功能都存在差異。筆者等主要對具有抗性功能的RPW8或其同源基因的研究成果進行綜述，并對RPW8基因在種群關系、抗病育種上的應用價值進行展望，以期為白粉病抗性調控、抗性育種等方面的研究提供參考。

1 RPW8基因的生理生化特征

1.1 RPW8基因的結構與序列特征

在擬南芥(Col-0生態型)基因組數據庫中(https：//www.arabidopsis.org)，HR4位于第3條染色體上。RPW8基因在親緣關系較近的不同生態型或近緣種中，基因位點相對固定，但可能由于重復片段插入、缺失、交換等事件發生，使得PRW8被同源基因取代或丟失，并在序列和功能方面存在較大差異。從圖1看出，Ms-0生態型擬南芥RPW8.1和RPW8.2基因位于HR3和SPK-2(SNF1-RELATED PROTEIN KINASE)之間，Col-0生態型的HR4也位于HR3和SPK-2之間。琴葉擬南芥(Arabidopsislyrata)則只有RPW8.2基因，位置在HR3和SPK-2之間。

注：At為擬南芥；Al為琴葉擬南芥。
Note: At，A.thaliana; Al，A.lyrata.
圖1擬南芥及其近緣種中RPW8基因的位點
Fig.1RPW8 locus ofA.thalianaandA.lyrata

RPW8基因在不同植物中的數量、基因長度、基因結構等方面存在較大差異(圖2)。在43個不同的生態型擬南芥的基因序列比對中，RPW8.1基因長度為718個核苷酸，包含長度分別為281 bp和229 bp的2個外顯子和1個208 bp內含子，編碼148個氨基酸；RPW8.2基因長度為653個核苷酸，包含長度分別為296 bp和229 bp的2個外顯子和1個183 bp內含子；編碼174個氨基酸。擬南芥RPW8.1(核苷酸多樣性π=0.012)和RPW8.2(π=0.010)系列比同源基因HR3(π=0.002)和HR4(π=0.002)的變化大。琴葉擬南芥和擬南芥上RPW8.2同源基因的核苷酸和蛋白序列相似度只有81%和61%。油菜(Brassicanapus)的4個BnHRs也只有2個外顯子和1個內含子，外顯子和內含子核苷酸多樣性在0.001～0.015。華東葡萄(Vitispseudoreticulata)中克隆到的5個RPW8基因(GenBank ID：KU365990、KU365991、KU365992、KX389173和KX389175)，編碼的蛋白長度在647～825個氨基酸，相似度為78%，每個基因包括5個外顯子和4個內含子。

注：At為擬南芥；Bn為油菜；Vp為華東葡萄。
Note:At,A.thaliana；Bn,B.napus；VP,V.pseudoreticulata.
圖2RPW8基因的結構
Fig.2 Structure ofRPW8 genes

1.2 RPW8氨基酸序列的重要位點

位于RPW8.2蛋白第64位、第116位和第161位的蘇氨酸(Thr-64)、天冬氨酸(Asp-116)和蘇氨酸(Thr-161)對白粉病的抗性至關重要，尤其位于卷曲結構域的Thr-64是蛋白磷酸化的關鍵位點，在過敏性抗病反應中起決定性作用。N端1～22位氨基酸為跨膜結構域TMD(Trans-membrane domain)，TMD的5～14位序列(VAAGGALGLA)在蛋白穩定和錨定白粉菌吸器外膜EHM(Extrahaustorial membrane)中起比較關鍵的作用。C端的111位亮氨酸也是錨定EHM的關健位點，缺少此位點及之后的序列也對蛋白錨定有影響。RPW8.2N端30個氨基酸對其與14-3-3λ(G-BOX FACTOR 14 LAMBDA或稱14-3-3 lambda)蛋白互作沒有影響，而C端的38個氨基酸則影響很大。通過酵母雙雜試驗發現，RPW8.2蛋白能與14-3-3 λ(At5g10450)蛋白互作，RPW8.1蛋白與14-3-3λ互作的能力很弱。

1.3 RPW8基因與R基因的關系

多數R抗病基因(Resistance Genes)編碼的蛋白通常具有1個核苷酸結合位點(Nucleotide-binding site ，NBS)和1個羧基端的亮氨酸重復系列(Leucine-rich repeats，LRRs)，因此亦將此類基因稱為NBS-LRR基因(文中用該名稱)或NBS基因。根據此特征可將NBS-LRR類R蛋白分為兩大類：一類是氨基含有1個TIR(Toll/interleukin receptor)域的TIR-NBS-LRR蛋白，或又稱TIR-NBS-LRR，簡寫為TNLs蛋白；另一類是無TIR結構域的none TIR-NBS-LRR蛋白，簡稱nTNLs蛋白。在nTNLs中，又將氨基端含有卷曲螺旋結合位點(Coiled-coiled motif)的蛋白歸類為CC-NBS-LRR蛋白，簡寫為CNLs蛋白[9-10]。亦有學者將此類R基因編碼的蛋白稱為NB-LRR蛋白(Nucleotide binding-leucine rich repeat)[11-13]。 NBS結構域通常包括P-loop(GxGKT)、Kinase2(LxxLDDV)、Kinase3或稱RNBS-B (GxxxxxT(T/S)R)、GLPL(GLPL)等保守結構，LRR結構域序列通常為xxLxLxx結構[14]。RPW8屬于nTNLs，N端含1個跨膜結構域TMD(N-terminal transmembrane domain)和1～2個卷曲螺旋結構域(Coiled-coil)，還具有R基因常有NBS和LRR結構域[15-17]，因此，有學者將RPW8歸為一類特殊類型R基因，即RPW8-NBS-LRR，簡寫為RNL，或者將其歸在X-NBS-LRR類型中[17-20]。

1.4 RPW8基因的起源與進化

在藻類植物中，灰色藻門(Glaucophyta) 和紅藻門(Rhodophyta)還沒有出現TNLs和CNLs基因，綠藻門(Chlorophyta)和輪藻門(Charophyta)才開始有NBS-LRR基因的出現；苔蘚植物如地錢(Marchantiapolymorpha) 、泥炭蘚(Sphagnumfallax)和開花植物中，NBS-LRR基因較豐富，但是單子植物中沒有TNLs類型基因[21]。RPW8雖屬于NBS-LRR基因，但在藻類植物中沒有出現，直到苔蘚植物(Bryophyta)才出現。其他的開花植物則存在數量不等的RPW8基因[22]。在草莓、蘋果、梨、桃和梅基因組中，預測的RPW8基因分別有24個、20個、22個、11個和13個[23]。截型苜蓿(Medicagotruncatula)、木豆(Cajanuscajan)、菜豆(Phaseolusvulgaris)和大豆(Glycinemax)中，RPW8基因分別有8個、4個、5個和9個。RPW8與ADR1(activated disease resistance gene)和NRG1(N-required gene 1)有較高的同源性，在基因的進化和形成過程中可能存在比較緊密的關系。RPW8基因可能從ADR1或NRG1進化而來，蕨類植物(Pteridophyta)，如石松門(Lycopodiophyta)以及單子葉植物中在進化過程中只保留ADR1和NRG1類似基因或數量極少的RPW8同源基因[24-25]。

2 RPW8基因的抗病功能

2.1 基因表達特點

培養基接種木霉菌(Trichodermaatroviride)試驗中，Col-0生態型擬南芥的HR4在接種后96 h，表達比對照提高4倍； Ms-0生態型擬南芥的RPW8.1在接種后96 h，表達比對照提高155倍，RPW8.2則不明顯[26]。通過PRW8.1-YFP(yellow fluorescent protein)和PRW8.2-YFP融合基因在洋蔥表皮細胞和擬南芥葉片表皮細胞表達后，兩者的亞細胞定位主要在膜系統上，包括細胞質膜、內質網和高爾基體。亞細胞定位過程中觀察到RPW8在細胞中有流動現象，這一現象在進一步研究后被證實是RPW8蛋白利用胞內小泡運輸(Vesicle trafficking)并通過微絲細胞骨架(Actin cytoskeleton)在細胞內轉運。通過轉基因植物中穩定表達PRW8.1-YFP和PRW8.2-YFP發現，PRW8.1主要在葉肉細胞中表達，很少在表皮細胞中表達，PRW8.2則在葉肉細胞和表皮細胞中均有表達[27]。

2.2 抗病作用

目前，RPW8抗病方面的研究以白粉病居多。將Ms-0的RPW8.1和RPW8.2基因中任何1個或2個同時轉化到Col-0中，轉基因植株都表現出提高白粉病抗性。異位表達(Ectopic expression)擬南芥RPW8.1基因，使得PTI﹝PAMP(Pathogen-associated molecular pattern )-triggered immunity﹞通路誘導的抗性相關的基因PRRs(Pattern recognition receptors)、FLS2(Flagellin Sensing2)、CERK1(Chitin elicitor receptor kinase1 )、BAK1(BRI1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE1)、BIK1(BOTRYTIS-INDUCED KINASE1)、PBL1﹝AvrPphB susceptible1 (PBS1)-like﹞、MPK3、MPK6和PBL2上調表達，以及PR1(Pathogenesis-related)、PR2和WRKY29上調表達，同時誘導H2O2產生，出現HR(Hypersensitive response)過敏性反應類似的細胞壞死癥狀。轉PRW8基因的煙草可提高白粉病的抗性，其對抗性調控依賴于SA(Salic acid)通路和EDS1(ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY1)通路，并伴隨著類似的HR反應；但同樣轉PRW8基因在蕃茄(Lycopersicon esculentum)上未表現出抗白粉病(Oidiumlycopersici)[28]。過量表達HR1、HR2和HR3基因也有提高白粉病抗性的作用，HR4則更易感白粉病；HR1、HR2和HR3敲除后，HR2和HR3敲除株系更易感白粉病[29]。感白粉病生態型和抗白粉病生態型的抗病雜交后代只對白粉菌分生孢子有抑制作用，而在病原菌其他的生活周期抗性不明顯[30]。當環境發生變化時，不同白粉病抗性的擬南芥植株也會發生一定變化[31]。RPW8對白粉病的抗性可能同時受到基因本身、遺傳背景和環境的影響。RPW8除了具有抗白粉病的功能外，可能還具有其他抗性作用，水稻中異源表達擬南芥RPW8.1基因表現出抗稻瘟病(Pyriculariaoryzae)和白葉枯病(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)[32]。華東葡萄(Vitispseudoreticulata)VpRPW8基因受霜霉病誘導表達，轉VpRPW8基因煙草(Nicotianabenthamiana)表現出抗疫霉病(Phytophthoracapsici)。轉PRW8基因擬南芥對霜霉病(Hyaloperonosporaparasitica)和花葉病毒(Cauliflowermosaicvirus)的抗性有提高作用；對假單胞菌(Pseudomonassyringaepv.maculicolaES4326)的抗性沒有影響，而更感鏈格孢菌(Alternariaspp.)和 灰霉菌(Botrytisspp.)[27]。

2.3 RPW8調控機制

SA、EDS1和NPR1都是植物抗病過程中的重要信號通路[33-37]。RPW8.1和RPW8.2對白粉病的抗性常需要SA和EDS1、PAD4、EDS5、NPR1的參與，并伴隨HR出現[15]。1998年篩選到edr1(Enhanced disease resistance 1)抗白粉病突變體，其沒有提高PR1和PR5的表達[38]。EDR1通過抑制RPW8.1和RPW8.2的轉錄，進而抑制HR細胞死亡和白粉病抗性[15]。EDR1負調控RPW8的抗性亦需要EDS1和SA的參與[15]，EDR1也聯系SA與ET(ethylene)[39]、ABA(abscisic acid)[40]信號通路之間的橋梁。EDR2突變體能增強白粉病的抗性，突變體中RPN1a蛋白起關鍵作用，RPN1a是蛋白降解系統中26S蛋白的一個亞基，也是edr1和pmr4白粉病性抗性調控所必需的，RPN1a基因突變使植株更易感白粉病[41]。XCT(X-CHROMOSOME ASSOCIATED PROTEIN5(XAP5) CIRCADIAN TIMEKEEPER)基因(At2g21150)正調控RPW8.1的抗性[42]，而XCT是ET信號通路中重要的調控因子[43]。14-3-3λ(GF14 lambda)正調控RPW8的抗性，14-3-3λ是真核生物普遍存在的調節蛋白，通過識別特異的磷酸化序列與靶蛋白互作，也是蛋白間相互作用的重要橋梁蛋白。14-3-3λ蛋白能夠與APX3 (Ascorbate peroxidase) 和AKR2互作，并可能參與植物氧化代謝過程。14-3-3λ還與BZR1轉錄因子互作，參與油菜素內脂信號通路BRs(Brassinosteroid signaling)。在酵母和植物體還能觀察到RPW8.2蛋白能與PAPP2C(Phytochrome-associated protein phosphatase type 2C，At1g22280)互作，RNAi干涉PAPP2C后，出現RPW8過表達的表現，即葉片出現敏性細胞死亡并提高白粉病抗性[44]。PP2C是通過調控CDK(Cyclin-dependent protein kinases)去磷酸化來調節細胞周期和細胞凋亡，PP2C還可通過去磷酸化作用調控MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信號通路，進而可能關聯病菌入侵寄主時細胞壁完整性過程[45-46]。與PRW8介導密切相關的基因ERH(Enhancing RPW8-mediated HR-like cell death)突變體erh表現為SA的積累和RPW8表達量的上升，ERH與酵母IPCS(Inositolphosphorylceramide synthase)同源，并編碼植物IPCS。IPCS是調控細胞PCD(Programmed cell death)的重要基因，在植物防疫反應中扮演著重要角色[47]。

白粉菌在入侵過程中形成吸器體(Haustorium)、吸器外質膜(Extrahaustorial membrane，EHM)和吸器外間質(Extrahaustorial matrix，EHMx)[48]，將白粉菌吸器從葉片組織中分離出來，可觀測到PRW8.2蛋白匯集到吸器外質膜上[49]，PRW8同源蛋白也有類似現象[29]。RPW8.2被白粉菌誘導表達后還激發過氧化氫在吸器復合體(Encasement of Haustorial Complex，EHC)內高濃度富集，同時激發富含胼胝質(Callose)的吸器復合體形成，并將高濃度的過氧化氫限制在吸器復合體內，從而達到抗病的效果而不傷害寄主細胞；在植株抗白粉病過程中，胼胝質沉積現象在其他抗病基因型中也起到十分關鍵的作用[50-51]。胼胝質沉積往往也需要SA的誘導和參與[52]。當EHC不足以阻止白粉菌的入侵時，RPW8.2表達量便不斷增加直至受侵染細胞死亡，從而消滅入侵的白粉菌[53]。RPW8.2-YFP不但可以錨定在白粉菌吸器外質膜上，也可以錨定霜霉菌吸器表面。但是，失去抗性功能的RPW8突變體即便可以錨定到吸器外質膜上，或者失去錨定功能的RPW8突變體均不能產生抗病性[54]。

RPW8的上調表達常伴隨著活性氧產生，過量的活性氧產生不僅對病原菌具有殺傷作用，同時也對寄主本身形成傷害，除EHC對寄主細胞保護外，黃嘌呤脫氫酶XDH1(XANTHINE DEHYDROGENASE1)對寄主保護也有重要作用。XDH1通過調控ROS過程，影響RPW8介導的白粉病抗性，黃嘌呤脫氫酶是植物幾種鉬酶之一，XDH即可在嘌呤代謝過程中催化黃嘌呤(xanthine)和次黃嘌呤(of xanthine)生成尿酸，還可轉化為黃嘌呤氧化酶還原酶(Xanthine oxidoreductase，XOR)促進ROS的產生。在白粉病侵染過程中，一方面XDH促進ROS破壞吸器的形成，另一方面作為看家酶類存在，代謝產生尿酸來保護寄主細胞免受活性氧的傷害。XDH1基因啟動子包括3個WRKY結合元件W-box(TTGACC/T)，預示其可能受WRKY的調控[55-56]。

3 展望

白粉病是最為常見的一種植物病害，白粉菌種類有600余種，每個種又存在或多或少的生理小種，其為害的植物寄主近萬種。在進化過程中，很多白粉菌(或生理小種)與相應的植物種類(或生態型)形成專一性的寄生關系，RPW8在這一進化過程中也發生了復雜遺傳變異的事件，這些事件是否與白粉病直接相關還有待深入研究。白粉病抗性調控基因除RPW8外，目前已報道在植物白粉病抗性調控中起重要作用的還有WRKY、PMR(powdery mildew resistant)、MLO(mildew locus O)和MLA(mildew locus A)等基因。RPW8在不同植物或生態型中的基因數量、結構、功能等方面有著豐富的變化，為白粉病抗性研究帶來了一定的難度，同時也帶來了機遇：當RPW8發揮抗病作用并占主導地位時，如何通過調控網絡與其他抗病基因協同調控；當RPW8失去抗病功能時，其在生命體中又扮演怎樣的角色，其他抗病基因如何彌補RPW8的抗病功能，使植株產生抗病性，這些都值得去探索。RPW8基因在同一類群內豐富的核苷酸多樣性和不同類群間高頻次的基因片段的插入、交換、缺失等事件的發生，使其成為種群關系甚至不同植物種類進化關系的研究提供了一個較好的切入點。隨著對RPW8基因研究的不斷深入，預期其可為不同種類植物白粉病的抗性機制、白粉病抗性育種等方面的研究和應用提供重要的參考價值。