瑤山雞TRH基因編碼區序列變異及其與繁殖性狀的相關性

伍革民，朱麗莉，韓 雪，唐繼高

(貴州省農業科學院 畜牧獸醫研究所，貴州 貴陽 550005)

促甲狀腺激素釋放激素(thyrotropin-releasing hormone，TRH)最早是從豬和綿羊的下丘腦分離出的一種釋放激素，其最經典的功能是調節垂體促甲狀腺激素的合成和分泌。該激素除分布于下丘腦、小腦、延髓等神經組織外，還分布于許多非神經組織中，如胰腺、免疫系統、胃腸道、睪丸、前列腺、精囊、附睪、胎盤、子宮、卵巢、皮膚、視網膜等，具有廣泛的生物學作用，如TRH參與心情與情感的調節，可用于抑郁癥的治療；調節睪酮的分泌，參與前列腺的局部自分泌，調控前列腺生長，可能與男性生育能力有關[2-3]；與雌激素及垂體血管活性腸肽等一起調控催產素和催乳素的分泌[4-5]。人TRH基因編碼含242個氨基酸的TRH激素原前體，TRH基因先被翻譯為激素原前體ppTRH，ppTRH除加工生成經典的TRH外，還可衍生出大量其他多肽，這些多肽具有不同的生物學功能，如ppTRHl78-199(pFE22)可抑制腎上腺皮質醇和PRL分泌，ppTRH178-185(pEQ7)和ppTRH186-199(pSEl4)參與釋放催乳素(PRL)[7-8]。在畜禽中，該基因主要與豬、牛的生長性狀以及斗雞的攻擊行為有關[9-12]。前期研究表明，瑤山雞TRH基因的受體(thyrotropin-releasing hormone receptor，TRHR)編碼區變異與雞繁殖性狀沒有顯著關聯[13]，但TRH基因自身的序列變異是否與雞繁殖性狀有關不明確。為此，檢測瑤山雞群體TRH基因編碼區序列變異情況，并與雞繁殖性狀進行關聯分析，以明確其作為繁殖性狀輔助選育基因的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

120日齡瑤山雞母雞60只，選自貴陽市烏當區百宜鄉洛壩村種雞場，常規飼養管理。轉入產蛋舍單只單籠飼養至300日齡，翅下靜脈采血1～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 性狀測定 測定開產體重、300日齡產蛋量，觀測開產日齡、首次就巢日齡、首次就巢持續時間、首次就巢至重新開產間隔和300日齡就巢次數等繁殖性狀，測定方法按照NY/T 823-2004[14]進行。

1.2.2 基因組DNA提取及引物設計 用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒提取DNA，根據GenBank數據庫中雞TRH基因編碼區及調控區序列(登錄號:NC_006099.3)設計引物(表1)，引物由天根生化科技有限公司合成。

表1 用于瑤山雞TRH基因型檢測的引物信息Table 1 Primer information for TRH genotype detection of Yaoshan Chicken

1.2.3 PCR擴增及測序 PCR反應體系:DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 試劑10 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應參數:95℃預變性6 min；95℃變性30 s，根據設定退火溫度退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用PCR產物回收試劑盒回收，60個樣本測序委托諾賽基因組研究中心有限公司檢測。

1.3 統計分析

用DNAstar軟件對測序結果進行校正，用BLAST分析序列SNPs，用DNAMAN軟件分析SNPs變異情況。TRH基因分型用Excel統計，用PopGen 32軟件分析群體多樣性，用SPSS 18.0采用單因子方差分析方法分析基因型與繁殖性狀的相關性。

2 結果與分析

2.1 TRH基因序列變異和群體遺傳多樣性

通過測序、分型及與GenBank數據庫序列比較，在60只瑤山雞中共檢測到4個變異位點，1個變異位點位于基因2299位置(內含子2)，相對于數據庫序列，瑤山雞所有樣本在此處缺失單堿基A；其余3個位點分別位于基因2458(內含子2)、2699(外顯子3)和3857(外顯子3)位置，位于基因2699位置的變異(A→T)導致該蛋白質第127位氨基酸發生錯義突變(谷氨酰胺Q→亮氨酸L:CAG→CUG)(表2)。

表2 瑤山雞TRH基因的SNP位點Table 2 The SNP loci of TRH gene in Yaoshan Chicken

從表3看出，瑤山雞TRH基因各位點的平均雜合度在0.2061～0.5000，多態信息含量在0.189 0～0.375 0，遺傳多樣性處于中下水平。經哈迪溫伯格平衡檢驗，各位點均沒有偏離平衡狀態(P>0.05)。

表3 瑤山雞TRH基因的遺傳多態性Table 3 Genetic polymorphisms of Yaoshan Chicken TRH gene

2.2 變異位點基因型與繁殖性狀的相關性

從表4可知，A2458G位點AA、AG及GG基因型的開產日齡、300日齡產蛋量、就巢性狀間差異均不顯著。A2699T位點AA與AT基因型的開產日齡、300日齡產蛋量、首次就巢日齡、首次就巢持續時間、300日齡就巢次數間差異顯著或極顯著。G3857T位點GG、GT、TT基因型的開產日齡差異不顯著，但300日齡產蛋量、就巢性狀間差異顯著或極顯著。說明，A2699T、G3857T的不同位點基因型與繁殖性狀存在顯著或極顯著關聯。

表4 TRH基因位點的繁殖性狀Table 4 Correlation between TRH gene loci and reproductive traits

注:同位點不同基因型繁殖性狀列不同大、小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。
Note:Different capital and lowercase letters in the same row means significant difference atP<0.01 andP<0.05 levels respectively.

3 結論與討論

候選基因鑒定法是分析數量性狀基因的重要方法之一。促甲狀腺激素釋放激素(TRH)具有廣泛的生物學作用，在睪丸、前列腺、精囊、附睪、胎盤、子宮、卵巢等生殖器官中分布，可促進催產素和催乳素的分泌。由此推測，TRH可能與性腺功能有關，因此將TRHR基因作為雞繁殖性狀關聯的候選基因之一，開展序列變異檢測并與繁殖性狀進行關聯研究。在GenBank數據庫檢索該基因SNP變異，到目前為止共檢測到1 572處SNP變異，這些變異主要分布于人，在雞中還沒有該基因SNP變異的記錄。TRH基因定位于雞12號染色體上，序列全長4 557 bp，包括3個外顯子和2個內含子。試驗針對外顯子區域進行設計，第一外顯子區域未能設計出合適的引物，設計引物P1擴增產物包含了完整的外顯子2序列，引物P2和P3擴增產物包含了外顯子3的編碼區域序列和部分非編碼區域序列。

TRH的經典功能是調節垂體促甲狀腺激素(TSH)的合成和分泌，在畜禽方面對該基因的研究主要集中于生長性狀，如促甲狀腺激素釋放激素基因在文山牛垂體組織中處于下調狀態，在西口塔爾牛和云嶺牛垂體組織中處于上調狀態，可能與南方黃牛生長發育有關；TRH基因多態座位ss325994933與金皮豬資源家系個體生長發育后期，尤其是150日齡、180日齡期間增重有顯著關聯，其在國內和國外豬種中的基因頻率亦存在明顯的對立分布差異[11]；吐魯番斗雞較強的攻擊行為可能與血清中TRH含量偏高有關，其下丘腦TRH mRNA相對表達量高于海蘭蛋雞[10]。研究結果表明，在瑤山雞群體中，TRH基因篩選到3個變異位點，其中，A2699T、G3857T變異位點與瑤山雞產蛋和就巢性狀存在顯著或極顯著關聯，說明該基因可能參與雞繁殖性狀的調控，可作為雞的繁殖性狀候選基因開展進一步研究和應用。TRH發揮生物功能需通過與其靶細胞表面的TRH受體(TRHR)結合，以激活胞內第二信使通路，從而調控基因表達而實現[11]。前期研究表明，TRHR基因多態變異與雞繁殖性狀不存在關聯，TRH基因參與雞的繁殖功能，與其自身變異有關，與TRHR基因無關，其調控雞繁殖性狀的分子機理有待進一步深入研究。