超低溫冷凍保存對西伯利亞鱘精子酶活性的影響

周 洲，李世凱，趙 飛，陳飛雄，孔 杰

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025)

西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)屬鱘形目、鱘科、鱘屬，生長速度快、魚籽醬品質(zhì)高，是目前我國鱘魚類人工養(yǎng)殖的主要品種之一。貴州自2012年實(shí)現(xiàn)西伯利亞鱘全人工繁育以來，目前養(yǎng)殖面積已超過8萬m2，優(yōu)質(zhì)苗種供應(yīng)不足已經(jīng)成為限制貴州鱘魚規(guī)模化養(yǎng)殖的瓶頸。精子超低溫冷凍保存技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對精子的長期保存，對魚類種質(zhì)資源保存和優(yōu)良品種的選育具有決定性的影響，目前已在日本鱘、中華鱘、西伯利亞鱘、史氏鱘和達(dá)氏鱘[1-5]等鱘魚類中有較多報(bào)道，但凍存激活后精子的活力和受精率難達(dá)到鮮精的水平。酶活性檢測法是評價(jià)精子超低溫冷凍保存效果的一種常用檢測辦法，目前已應(yīng)用于大黃魚、花鱸、長鰭籃子魚及俄羅斯鱘等魚類精子超低溫冷凍保存研究中[6-9]。因此，試驗(yàn)通過分析超低溫冷凍前后西伯利亞鱘精子酶活性的變化，檢測鮮精和凍精質(zhì)量，探討超低溫冷凍保存對精子酶活性的影響，以期對西伯利亞鱘精子超低溫冷凍保存體系優(yōu)化及冷凍精子保存效果提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 西伯利亞鱘精液樣本的采集和制備

1.1.1 樣本采集 親本均來自貴州省水產(chǎn)研究所惠水養(yǎng)殖基地。于2019年4月在西伯利亞鱘繁殖期間，選體長(1.42±0.25)m、體重(18.6±3.5)kg的性腺發(fā)育成熟的雄魚5尾，進(jìn)行人工催產(chǎn)取精。取精時(shí)，用干凈的干毛巾擦去鱘魚體表和生殖孔周圍的水分及污物，將生理鹽水洗凈的塑料軟管輕輕插入生殖孔，用手輕輕擠壓其腹部使精液自然經(jīng)導(dǎo)管流入干凈干燥的50 mL離心管中，并通過計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)快速檢測精子活力情況，選取精子活力大于90%的精子樣本用于試驗(yàn)。

1.1.2 樣本制備 將采集的精液分為2組，即鮮精組(對照)和凍精組。選取體積分?jǐn)?shù)15%的二甲基亞砜(DMSO)作為抗凍劑，以KCl 0.25 mmol/L、蔗糖23.4 mmol/L、Tris-HCL 10 mmol/L(pH 8.5)作為稀釋液[10]，將精液以1∶1的體積比加入配制好的抗凍保護(hù)液，混勻平衡后，將裝有精液的冷凍管置于液面以上6 cm處平衡2 min，之后在液面以上2 cm處平衡2 min，最后在平行于液氮面平衡2 min后投入液氮中。精子解凍時(shí)將凍存管從液氮中取出，立即放入備好的恒溫為37℃的水浴鍋中，輕輕搖晃至凍存管中沒有小絮狀冰塊為止。解凍后的精子經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)分析精子活力在30%左右，將2個(gè)處理組的樣本在3 000 r/min、4℃條件下離心15 min，去除精漿后，向白色精子沉淀中加入0.9%生理鹽水洗滌，同樣條件下離心、洗滌2次，最后將精子置于-20℃冷凍保存。待需要檢測時(shí)，將樣本放置于4℃條件下緩慢融化，繼續(xù)在3 000 r/min、4℃條件下離心 15 min，取上清液中間位置用于西伯利亞鱘精子內(nèi)相關(guān)酶活性的檢測。

1.2 酶活性的檢測

采用南京建成生物工程研究所的酶活檢測試劑盒測定西伯利亞鱘精子內(nèi)總ATP酶(Totoal ATPase)、谷胱甘肽還原酶(GR)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、過氧化氫酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)的酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)設(shè)5個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 19.0對西伯利亞鱘精子冷凍前后各種酶活性的差異顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超低溫冷凍前后西伯利亞鱘精子能量代謝的酶活性

從圖 1可知，西伯利亞鱘新鮮精子中總ATP酶、CK酶、LDH酶和SDH酶的活性均是新鮮精子高于超低溫冷凍保存的精子，其中，超低溫冷凍前后西伯利亞鱘精子總ATP酶的平均活力由(18.77±1.23)U/mL降至(16.32±0.87)U/mL，CK酶由(6.64±0.58)U/mL降至(5.27±0.23)U/mL，LDH酶由(6 695.78±123.47)U/L降至(4 388.32±93.28)U/L，SDH酶由(24.91±1.63)U/mL降至(17.45±0.94)U/L。超低溫冷凍前后總ATP酶活性差異不顯著性(P>0.05)，CK酶、LDH酶和SDH酶的活性差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

2.2 超低溫冷凍前后西伯利亞鱘精子的抗氧化酶活性

從圖2可知，超低溫冷凍后西伯利亞鱘精子中SOD酶和CAT酶活性均低于新鮮精子，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)；GR酶活性則高于新鮮精子，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。其中，超低溫冷凍前后SOD酶平均活力由(61.99±4.15)U/mL降至(46.38±2.54)U/mL，CAT酶由(112.33±6.38)U/mL降至(67.58±3.87)U/mL，GR酶由(23.36±1.69)U/mL增至(94.61±4.13)U/mL。

注：同一圖中不同小寫字母表示差異達(dá)5%顯著水平。
Note:Different lowercase lellers in the same graph indicate significance of difference atP<0.05 level.
圖1西伯利亞鱘精子超低溫冷凍保存和新鮮精子中能量代謝的酶活性
Fig.1 Total enzyme activity of energy metabolism of cryopreservation and fresh spermatozoa inA.baerii

3 結(jié)論與討論

魚類精子內(nèi)的能量代謝酶與精子的活力有密切的關(guān)系，目前精子內(nèi)常見的能量代謝酶有總ATP酶、SDH酶、CK酶及 LDH酶等，其酶活性可以用來分析精子質(zhì)量[11-13]。ATP酶可將其酶解釋放的能量用于生命體各項(xiàng)生命活動(dòng)，精子開展各種需能活動(dòng)都需要ATP酶以獲得能量，因此可用ATP酶活性判斷精子是否受到損傷[14]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體特征酶SOD活性可判斷超低溫冷凍前后精子內(nèi)線粒體功能是否受損[12,15]。LDH酶是精子能量代謝過程中的一種糖酵解酶，可通過呼吸作用給精子提供能量，因此該酶的活性可以作為衡量精子質(zhì)量的一個(gè)生化指標(biāo)[16]。CK酶通常存在于各類細(xì)胞漿和線粒體中，是與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)和 ATP酶再生有直接關(guān)系的重要激酶[17]。黃曉榮等對大黃魚精子的研究表明，經(jīng)過超低溫冷凍保存后，大黃魚精子中總 ATP酶、CK酶、SDH酶和 LDH酶的活性均顯著低于鮮精。徐濱等[18]研究表明，超低溫冷凍后俄羅斯鱘精子的總 ATP酶、SDH酶、LDH酶和CK酶的平均活性均下降。國外學(xué)者研究超低溫冷凍保存對虹鱒 (Oncorhynchusmykiss)精子中能量代謝酶酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，超低溫冷凍后精子中LDH酶、CK酶及總ATP酶的活性均呈顯著降低趨勢[19]。筆者等研究也發(fā)現(xiàn)，超低溫冷凍保存后，凍精中的總ATP酶、SDH酶、CK酶及 LDH酶等能量代謝相關(guān)酶活性均降低，其中SDH酶、CK酶及 LDH酶活性顯著降低，表明超低溫冷凍保存對鱘魚精子相關(guān)生命活動(dòng)產(chǎn)生了影響，從而降低了鱘魚精子的受精能力。一方面可能是由于超低溫冷凍對精子能量代謝相關(guān)酶的結(jié)構(gòu)造成一定的傷害，另一方面也可能是超低溫冷凍保存及解凍使精子受到機(jī)械損傷，從而導(dǎo)致精子內(nèi)的相關(guān)酶從細(xì)胞膜中溢出。在長鰭籃子魚精子、日本鰻鱺[20]等魚類超低溫冷凍保存研究報(bào)道都得出一致的結(jié)論。同時(shí)，西伯利亞鱘凍精中總ATP酶未出現(xiàn)顯著降低，也反映了試驗(yàn)采用的西伯利亞鱘精子冷凍保存劑具有較好的保護(hù)作用，可以用于長期超低溫冷凍保存西伯利亞鱘精子。

氧化酶活性的變化可以反映細(xì)胞在不同外界環(huán)境下的生理狀態(tài)，是用來判斷其是否受到損傷的重要生理指標(biāo)[8,21]。相關(guān)研究報(bào)道[9,22]均表明，魚類精子抗氧化酶SOD及CAT都與精子的活力具有密切的關(guān)系。GR酶是一種黃素酶，其在緩解因冷脅迫所產(chǎn)生的活性氧危害也具有重要的作用[23]。國內(nèi)學(xué)者研究超低溫冷凍保存對中國花鱸、長鰭籃子魚、俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedti)以及日本鰻鱺[20]等魚類精子酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，凍存后精子內(nèi)的抗氧化酶呈現(xiàn)不同的變化，其中精子內(nèi)SOD及CAT酶活性顯著下降，而精子內(nèi)GR酶活性則顯著上升。筆者等的研究結(jié)果表明，經(jīng)超低溫冷凍保存后，西伯利亞鱘精子的GR酶活性顯著高于鮮精，SOD酶、CAT酶活性均顯著低于鮮精，與上述研究報(bào)道相一致。SOD酶和CAT酶活性顯著降低，表明超低溫冷凍對西伯利亞鱘精子細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)造成損傷，從而不能及時(shí)清除氧化還原循環(huán)產(chǎn)生的大量活性氧，進(jìn)而造成對精子的一系列氧化損傷，從而導(dǎo)致精子受精能力降低。同時(shí)，GR酶的升高又驗(yàn)證了其活性可以保護(hù)精子免受外界冷凍脅迫中發(fā)揮重要作用。但目前有關(guān)GR酶在魚類精子超低溫冷凍保存中如何發(fā)揮作用的機(jī)制原理尚未見研究報(bào)道。

魚類精子超低溫冷凍保存技術(shù)對物種遺傳種質(zhì)資源保護(hù)及苗種生產(chǎn)都具有重要價(jià)值，貴州省水產(chǎn)研究所實(shí)現(xiàn)了對西伯利亞鱘精子超低溫冷凍保存技術(shù)的突破，但凍存激活后精子的活力和受精率總難達(dá)到鮮精的水平。筆者等研究對超低溫冷凍前后西伯利亞鱘精子總ATP酶、GR酶、CK酶、LDH酶、SDH酶、CAT酶及SOD酶等7種酶活性進(jìn)行研究，其中凍精中總ATP酶、SDH酶、CK酶和 LDH酶等4種能量代謝相關(guān)酶，SOD酶和CAT酶等2種抗氧化酶活性均有所降低，這在一定程度上解釋了凍精的受精能力顯著低于鮮精。因此，在開展魚類精子超低溫冷凍保存條件摸索過程中，可以通過比較凍精中相關(guān)酶活性的高低判斷凍精受精能力的大小，從而指導(dǎo)尋找魚類精子超低溫冷凍保存最優(yōu)的稀釋液和抗凍劑。