秀麗隱桿線蟲與FUdR在抗衰老研究中的應用

王素娟，趙耀，王曉雪，程翠婷，伊克運，張肖

（河南大學第一附屬醫院 老年科，河南 開封）

0 引言

隨著社會進步，生活水平的提高，人們對于長壽這一問題越來越關注，因此對如何長壽、如何抗衰老的研究也越來越多，比如各種中草藥、西藥、中藥與西藥結合、各種保健品等，使其作用于各種生物模型，觀察其生命周期的長短，以此來評價藥物是否有延長或縮短壽命的療效，間接判斷是否可以引起長壽。

由于小鼠生存周期比較長，一般2-3年，價格比較昂貴，制作模型也比較麻煩， 操作不可控性因素較多，因此一般不用做衰老模型的首選。細胞生物是一種獨立于個體之外的實驗，對環境要求比較嚴格，由于獨立個體之外，不能完全解釋機體內變化。相比于前兩者，秀麗隱桿線蟲是一種整體的多細胞生物，在其基因組中有42%基因與人類疾病存在相關性[2]，生存周期短，操作簡單，是實驗中應用最廣泛的模型，而且可以通過基因敲除技術得到實驗所需要不同基因型的突變體。

1 衰老的介紹

衰老（Senility）的研究最早來自西方，而不是東方，人類對于衰老的認識經歷了三個階段[3]，即神學階段、形而上學階段、科學證實階段。在中醫中，衰老有其獨特的理論，冀敦福等[4]總結提出以下學說：先天說、后天說、五臟虛陰說、陰陽失調說、氣運失常說等。20世紀后期，隨著老年醫學引入分子、細胞生物學理論與技術，衰老機制研究從整體水平上升到細胞水平[5]。近半個世紀以來，已經提出一系列衰老學說，印大中等[6]總結出衰老學說主要包括：整體水平衰老學說、器官水平學說、細胞水平衰老學說和分子水平衰老學說等。陳文等[7]認為其中最具代表性的衰老學說是“端粒衰老學說”“自由基衰老學說”等。

2 秀麗隱桿線蟲的介紹

秀麗隱桿線蟲是世界范圍內發現的微小的、自由生存的生物[8]，身體基本結構包括：口、咽、腸、性腺、肌肉、神經等結構，通常分為雌雄同體和雄性線蟲兩種，兩者的主要區別在于尾部的形態，雌雄同體的線蟲尾部較為細長，雄蟲尾部相對較粗且呈鈍圓狀見（見圖1）。其中雌雄同體占99.8%-99.9%，雄性只占0.1-0.2%，這是由于雌雄同體的性腺形成一個卵子睪丸，可以在受精之前暫時產生卵子，每個成蟲大約可以產生300個后代，這有利于大量繁殖。科研實驗一般都是用的雌雄同體。

圖1 雌雄同體秀麗隱桿線蟲）

秀麗隱桿線蟲發育主要包括胚胎期、幼蟲期和成蟲期三個過程，其中胚胎期是指從卵孵育到L1期的線蟲，L1期線蟲體積小，長度大約0.25mm。幼蟲期包括L1、L2、L3、L4四個時期，L4期線蟲蛻皮之后成為成蟲（見圖2）。在L2期，如果出現外界環境不適應（溫度過高或過低）或食物缺乏，線蟲生長就會停止，激活另一個生命周期[9]，進入一種休眠狀態，稱為“Dader”幼蟲。此期線蟲個體較L3期瘦小，但它可以長時間保持這種狀態，如果外界環境變為正常，此期線蟲可以直接跨越L3期而進入L4期，利用這種特征，可以使用低溫冷凍技術保存線蟲[10]。

圖2 不同時期的秀麗隱桿線蟲

秀麗隱桿線蟲的結構簡單，生命周期短，大約2-3周左右，可以通過基因敲除得到所需目的基因，也就是特定突變體，比如daf-2、daf-16，這就使得它成為實驗的良好模型。這不僅與它具有一個強大的遺傳系統外，還有其本身的優勢，包括：體積小、產卵量大、易于培養、費用低、保存時間長、傳代快、透明度高。另一個有利特征是，這種微生物對人體是無害的。正是由于以上幾種特點，秀麗隱桿線蟲被人們認為是最簡單、最高效、便宜的模型。

在1963年，已經在DNA、RNA和遺傳密碼方面取得成功的Sydney Brenner[11]提出，生物研究的未來在于模型生物，Brenner認為，生物研究需要一個系統，它可以在實驗中大量生長，成本低，并有一個簡單的計劃，他選擇秀麗隱桿線蟲扮演這一角色，自那以后，秀麗隱桿線蟲成為了研究衰老的模型系統之一，目前已有1200多家實驗室在用秀麗線蟲作為實驗模型。秀麗隱桿線蟲在神經退行性疾病中應用也比較多，比如阿爾茲海默病（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson，s disease,PD）、肌萎縮側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等。

3 5-氟-2’-脫氧尿苷（FUdR）的介紹

5-FLUORO-2’-DEOXYURIDINE是5-氟-2’-脫氧尿苷的全稱，簡稱FUdR，分子式：C9H11FN205,分子量：246.1924，純度99%。FUdR一種高效低毒的抗代謝類細胞周期特異性抗腫瘤藥，雖屬氟尿嘧啶類，但有其獨特的藥理作用，主要通過抑制胸腺嘧啶核苷合成酶的活性來發揮作用，從而抑制DNA、RNA合成。正是由于這一點，實驗用的FUdR通過抑制DNA合成，從而抑制線蟲產卵，保證實驗同質性。目前已是秀麗隱桿線蟲實驗中必不可少的一種藥物。

4 （FUdR）與秀麗隱桿線蟲在抗衰老中的應用

秀麗隱桿線蟲是目前常用且高效的抗衰老模型，由于其從受精卵到發育至成蟲過程中存在時間的差異，在光學顯微鏡下會觀察到各個時期（L1-成蟲）的線蟲，尤其在性成熟之后，線蟲會大量繁殖，需要操作者每隔一天或者每天挑出成蟲，有時剛成熟的線蟲與已經成熟幾天的線蟲難以區分開來，這給實驗很大麻煩，難以保證線蟲的同質性。Mitchell等[12]在1979年發現用FUdR處理發育L4的線蟲，可以抑制其繁殖和后代的生長，從而保證實驗的可行性。

迄今為止，FUdR對壽命的影響不僅僅局限在野生型線蟲（N2）中觀察[13]，在其他不同突變體的秀麗隱桿線蟲也有不同影響。FUdR對野生型N2壽命影響非常不明顯，但在GAS-1突變體中可以使線蟲壽命延長2倍[14]，可以使tub-1壽命延長8%。在Wang H等[15]實驗中發現，FUdR在不同時期處理線蟲，對其生存率影響也是不同的。在L4、Day1期用 50μM的FUdR處理，會使壽命顯著且輕微縮短3.5%和5.9%；在Day2、Day3期用FUdR處理，壽命增加了8.5%和8.8%，這可能是在早期應用FUdR可以干擾發育，對健康產生有害影響，加速腸道萎縮；而后期主要影響衰老病理方面，延緩壽命縮短。在Kato Y等[16]人實驗中發現FUdR可以使Fem-3、EXO-3壽命延長，并指出FUdR對壽命的影響可能包括兩方面：一是干擾生育，延長壽命；二是導致DNA堿基損傷，縮短壽命。不同濃度的FUdR對線蟲影響也是不完全相同的，低濃度（10-25）FUdR對野生型n2 的lifespan影響不大[17]，較高濃度才會對lifespan有影響。

5 結論與展望

衰老是一種常見現象，如何抗衰老一直是困擾人們的難題？秀麗隱桿線蟲是一種結構簡單，生命周期短的多細胞生物，目前在抗衰老研究中發揮著舉足輕重的作用。雖然目前FUdR在線蟲壽命中的機制還不是很明確,實驗已經發現FUdR對不同突變體線蟲的壽命影響是不同，不同時間點給藥對線蟲壽命影響也是不同。FUdR對秀麗線蟲壽命的影響是延長還是縮短，可能與給藥時間點有一定相關性，在早期給藥可以導致線蟲壽命縮短，在晚期或較后期給藥可以延長壽命。未來我們希望可以了解不同品牌來源的FUdR對同一線蟲壽命是否有影響？每個實驗都要具有可重復性,有的實驗很難重復出來，或許可能是每個實驗室所選擇的FUdR來源不同，是否是這一原因需要我們進一步研究。