甲狀旁腺素聯合降鈣素對大鼠骨質疏松的治療作用

何嘉 張遠成 楊亞軍 劉丹 孟慶飛

唐山市豐潤區人民醫院骨一科，河北唐山064000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量骨密度(bone mineral density，BMD)降低，骨組織微結構退化，骨強度下降，骨組織脆性增加，骨折危險性增大為特點的進行性、系統性、全身性骨骼疾病［1］。骨折是其最嚴重的并發癥，嚴重威脅人們的生命健康。因此，骨質疏松癥的及時預防和有效治療已成為當務之急［2］。目前，臨床治療骨質疏松的藥物主要包括激素調節藥物、加速骨形成藥物、促進骨礦化藥物等，這些藥物對治療OP有一定的療效，但也伴有一定的嚴重副作用，如長期激素治療出現的血液高凝狀態及誘發子宮內膜癌、乳腺癌等風險［3］。而甲狀旁腺素聯合降鈣素防治OP以其安全、毒副作用小，且可全身整體調節等特點，在治療上有較大優勢，更易于患者接受。因此，本研究探討甲狀旁腺素聯合降鈣素對去卵巢大鼠骨質疏松的治療作用，為臨床藥物治療OP提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級雌性SD大鼠100只，4月齡，體重(360±30)g，訂購于北京維通利華實驗動物技術有限公司［許可證號:SYXK(京)2017－0033］，重組人甲狀旁腺激素(1－34)(100μg/支，批號:1708072，美國Sigma公司)，鮭降鈣素注射液(密蓋息)(50 IU/支，批號:1609045，瑞士諾華制藥有限公司)，Ca、P、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒購于南京建成生物工程公司，7170A全自動生化分析儀購于日本日立公司，雙能X線骨密度測定儀購于美國GE公司，MTS－858型生物力學實驗機購于美國MA公司，大鼠 ER、血清骨鈣素(osteocalcin，OC)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、RANKL酶聯免疫檢測試劑盒購于美國R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及處理:100只雌性SD大鼠按隨機數字法分組:假手術組、去勢組、甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯合用藥組。假手術組僅切除部分脂肪組織，去勢組、甲狀旁腺素組、降鈣素組、聯合用藥組均行雙側卵巢切除術。造模成功后第2天給予藥物干預，假手術組、去勢組:皮下注射0.9%Nacl，1次/d;甲狀旁腺素組:皮下注射 PTH(1－34)50μg/kg，1次/d;降鈣素組:皮下注射降鈣素5～10 IU/kg，1次/d;聯合用藥組:皮下 PTH(1－34)50μg/kg，1 次/d，皮下注射降鈣素5～10 IU/kg，1次/d。

1.2.2 構建大鼠去卵巢骨質疏松動物模型:10%水合氯醛腹腔麻醉，備皮消毒，取腹背部中線第2腰椎水平做長約2 cm縱行切口，依次分離進入腹腔，沿輸卵管尋找粉紅色卵巢組織，嚴密結扎輸卵管及其周圍血管、脂肪組織，完整切除雙側卵巢，假手術組取出卵巢周圍等量脂肪組織，不予切除卵巢，關閉腹腔，逐層間斷縫合，術后肌肉注射青霉素［5萬U/(kg·d)］3 d，預防感染。

1.2.3 標本取材與處理:給藥干預8周后，給予10%水合氯醛腹腔麻醉后，采用快速心臟急性大失血法處死大鼠，取血8～10 mL，高速冷凍離心3 000 r/min，10 min，EP 管收集上層血清 0.5～1 mL，－20℃保存備用，待骨代謝生化指標和標志物檢測。逐層剝離L4腰椎和股骨，以無菌生理鹽水濕紗布包裹置于－20℃的冰箱保存備用，以行腰椎和股骨骨密度和生物力學檢測。另留取股骨10%甲醛溶液固定，10%EDTA 6周，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成5 μm切片，60℃烤箱4 h，取出室溫保存備用。

1.2.4 BMD和骨礦物質含量(bone mineral content，BMC)測定:取出待測大鼠 L4腰椎和右股骨，在LUNAR雙能X線吸收掃描儀掃測，采用小物體掃描模式，以分辨率1.0 mm×1.0 mm，掃描速度60 mm/s，掃描寬度5.0 cm的參數值，用儀器選定興趣區，以2.0 mm×2.0 mm為中心區域，檢測BMD和BMC值。

1.2.5 大鼠骨生物力學檢測:取出右側股骨，將大鼠股骨置于電子生物力學材料試驗機進行三點彎曲力學試驗，儀器調試正常后固定骨標本位置，右股骨橫切面為準，支點跨距為20 mm，加載速度2 mm/min給予股骨載荷，計算機記錄記錄儀描記載荷一變形曲線，根據荷載變形曲線得出最大荷載。

1.2.6 血清雌二醇(E2)檢測:采用ELISA法檢測血清中E2水平，參照試劑盒說明書進行逐步操作。

1.2.7 骨代謝相關生化指標檢測:取出上清液，采用7170A全自動生化分析儀檢測相關生化指標:血鈣(Ca)、血磷(P)、ALP，Ca、P、ALP 檢測均采用比色法測定，均按試劑盒說明書步驟操作。

1.2.8 骨代謝標志物檢測:取出各組上清液樣本，采用ELISA法測定血清OC、OPG、核因子κB受體活化因子(receptor activator of NF－κB，RANK)含量，參照試劑盒說明書進行逐步操作。

1.2.9 HE染色:取出石蠟切片，參照HE染色法實驗步驟進行操作［4］，光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.3 統計學分析

運用SPSS 20.0軟件分析，實驗數據采用珋x±s表示，統計學分析采用單因素方差分析，組間比較采用SNK法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨組織BMD和BMC

去勢組較假手術組腰椎(L4)和股骨BMD和BMC顯著降低(P＜0.05)，甲狀旁腺組、雌二醇組、聯合用藥組均較去勢組腰椎(L4)和股骨BMD和BMC均增高，其中尤以聯合用藥組增高最顯著(P＜0.05)。見表1。

表1各組大鼠腰椎和股骨的BMD和BMC比較(珋x±s)Table 1 Comparison of BMD and BMC between lumbar vertebrae and femur among the groups(珋x±s)

2.2 骨生物力學

假手術組、去勢組、甲狀旁腺組、降鈣素組、聯合用藥組最大負荷(N)分別為:203.60±20.50、125.26±12.62、156.35±15.36、160.48±14.25、188.56±18.43。去勢組較假手術組股骨最大負荷顯著降低(P＜0.05)，甲狀旁腺組、降鈣素組、聯合用藥組均較去勢組股骨最大負荷顯著增高，其中尤以聯合用藥組增高最顯著(P＜0.05)。

2.3 血清雌二醇(E2)

假手術組、去勢組、甲狀旁腺組、降鈣素組、聯合用藥組血清 E2含量(pg/mL)分別為:75.35±10.30、24.50±8.43、36.80±8.65、43.65±8.50、58.04±9.32。去勢組較假手術組股血清E2顯著降低(P＜0.05)，甲狀旁腺組、降鈣素組、聯合用藥組均較去勢組血清E2顯著增高，其中尤以聯合用藥組增高最顯著(P＜0.05)。

2.4 骨代謝相關生化指標

去勢組血清 Ca、P顯著低于假手術組(P＜0.05)，血清ALP顯著高于假手術組(P＜0.05)，甲狀旁腺組、降鈣素組、聯合用藥組血清Ca水平均高于去勢組，其中尤以聯合用藥組增高最顯著(P＜0.05)，甲狀旁腺組組、降鈣素組、聯合用藥組較去勢組血清ALP均降低，其中尤以聯合用藥組降低最顯著(P＜0.05)。見表2。

2.5 骨代謝標志物

去勢組血清OC、RANK水平顯著高于假手術組(P＜0.05)，甲狀旁腺組、降鈣素組、聯合用藥組較去勢組血清OC、RANK水平均降低，其中尤以聯合用藥組降低最顯著(P＜0.05)。去勢組血清OPG水平顯著低于假手術組(P＜0.05)，甲狀旁腺組、降鈣素組、聯合用藥組較去勢組血清OPG水平均升高，其中尤以聯合用藥組升高最顯著(P＜0.05)。見表3。

表2各組大鼠血清骨代謝生化指標比較(珋x±s)Table 2 Comparison of serum biochemical markers among the groups(珋x±s)

表3各組大鼠血清骨代謝標志物比較(珋x±s)Table 3 Comparison of serum bone metabolism markers among the groups(珋x±s)

2.6 骨組織病理學

假手術組骨組織結構完整，大量成熟骨組織，骨小梁粗細均勻，結構完整，生長旺盛，排列致密有序，互相交錯呈網狀，成骨細胞形態清晰可見。去勢組骨小梁明顯減少，排列稀疏錯亂，部分出現大片斷裂現象，大量纖維組織，骨細胞少見，鈣鹽沉積明顯減少。甲狀旁腺組和降鈣素組骨組織結構較完整，骨小梁相對完整，骨小梁生長稍稀疏，小梁間有少量斷裂，間隙略增大，排列尚規則，成骨細胞相對較少。聯合用藥組骨組織結構完整，板層結構致密，骨細胞排列整齊，骨小梁致密豐實粗壯，形態結構規整，連續性好，鈣鹽沉積。見圖1。

3 討論

骨折是OP最嚴重的并發癥，骨質疏松患者一旦發生骨折，生存質量急劇下降，給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔［5］。隨著全球人口老齡化的快速進展，骨質疏松癥的發病率亦逐年增加。加之老年患者對OP認識度不足，對治療的依從性差，從而導致臨床診治的困難增加，也加大了骨折的發生率和病殘率［6］。因此，如何防治OP和預防其并發癥就顯得極為重要。

甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)是由甲狀旁腺分泌的骨代謝過程中重要的調節因子，不僅可增加成骨細胞數量，促進骨生長因子釋放，增加骨量骨密度，從而促進骨形成，而且可增強破骨細胞活性，促進骨吸收，它在維持骨穩態的過程中發揮著雙重調節作用［7］。同時，PTH還可誘導成骨細胞分化，促進膠原合成和骨組織礦化，且可以抑制成骨細胞的凋亡［8－9］。PTH(1－34)是甲狀旁腺素中具有活性的氨基酸序列，和PTH具有相同和相似的生物活性和作用機制，可刺激骨形成，增加骨強度，改善骨結構和增加骨量，具有一定的成骨作用［10］。

降鈣素是調節骨代謝的重要激素，降鈣素通過與破骨細胞的受體結合，不僅能抑制破骨細胞的活性，而且還能阻止它的生成，從而抑制骨組織的自溶和吸收，減少骨骼中鈣和骨基質的流失，抑制骨轉化［11］。同時降鈣素增加骨質礦化，防止骨量丟失，增加骨礦含量，提高骨密度［12］。此外，研究還表明降鈣素能作用于成骨細胞，刺激成骨細胞增殖和分化，促進骨小梁的改建，促進骨折愈合［13］。鮭魚降鈣素(salmon calcitonin，sCT)是一種人工合成的生物制劑，對其受體具有很強的親和力，其活性高，且藥效更持久。由于sCT起效迅速，療效佳，使用方便，不良反應較少，安全性更好。因此，臨床普遍用于治療骨質疏松癥等疾病，療效逐漸被廣泛認可。

本研究表明甲狀旁腺素聯合降鈣素通過提高雌激素水平，調節維持骨代謝，提高骨密度和礦物含量，改善生物力學性能，改善骨組織病理形態學，起到抗骨質疏松的療效和骨保護作用。周蕓帆等［14］研究表明PTH(1－34)與降鈣素都能顯著提高BMD和緩解骨質疏松癥狀，對于治療骨質疏松安全有效。劉海蔚等［15］研究表明國產PTH(1－34)聯合降鈣素能明顯增加腰椎 BMD，升高骨轉換指標，治療PMOP安全有效。金成春等［16］研究表明PTH聯合sCT治療老年骨質疏松合并Garden I股骨頸骨折是一種安全、療效更好的方法。

綜上所述，本研究表明甲狀旁腺素聯合降鈣素能減少骨量的丟失，促進骨礦化，提高骨密度，改善骨質量，提高骨的生物力學特性和抗骨折能力，降低骨折的發生率。雖然甲狀旁腺素聯合降鈣素在治療骨質疏松癥起到了很大功效，但仍有許多問題需要解決，如不同的給藥方法可引起的完全不同的生物效應，用藥的準確療程，長期用藥的耐藥性問題，遠期并發癥及藥物具體作用機制等一系列問題限制了藥物的長期使用，隨著上述問題的解決，甲狀旁腺素和降鈣素的應用空間將更加廣闊。

圖1HE染色觀察骨組織的形態結構變化(×200)A:假手術組;B:去勢組;C:甲狀旁腺組;D:降鈣素組;E:聯合用藥組。Fig．1 Observation of morphological changes of bone tissue with HE staining(× 200)A:Sham operation group;B:Castration group;C:Parathyroid group;D:Calcitonin group;E:Combination group．