抑制COX-2表達(dá)對心肌缺血再灌注損傷過程中心肌細(xì)胞保護(hù)作用的研究

賈 丹，張 媛，連 鑫，龐 磊，麻海春，姜 曦

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 1.泌尿外二科；2.麻醉科；3.健康管理中心，吉林 長春130021)

研究表明在缺氧缺血的心肌細(xì)胞中，環(huán)氧化酶(COX-2)呈高水平表達(dá)，且其表達(dá)水平直接影響心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的嚴(yán)重程度[1-3]。雖然介導(dǎo)心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷(MI/RI)的分子機制尚未完全明了，但MI/RI過程可能涉及眾多潛在的病理生理學(xué)機制，例如細(xì)胞凋亡的激活、活性氧(ROS)的形成，以及炎癥反應(yīng)等。本研究通過對大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)進(jìn)行缺氧/復(fù)氧(H/R)實驗，研究MI/RI過程中，COX-2表達(dá)水平與細(xì)胞損傷之間潛在的因果聯(lián)系與分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

將大鼠心肌細(xì)胞H9C2(ATCC公司，美國)隨機分為三組：對照組(CTL)、缺氧/復(fù)氧組(H/R)和給藥組[H/R+10 μM Helenalin(H/R+H)，或H/R+10 μM NS398(H/R+N)][4]，細(xì)胞培養(yǎng)及處理方法詳見文獻(xiàn)[5]。

1.2 細(xì)胞活力檢測

采用乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測試劑盒(Roche公司，德國)檢測不同組別細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH的活性，判定各組細(xì)胞損傷的程度[6]。

1.3 免疫印跡試驗

采用免疫印跡方法對各實驗組細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，檢測所需抗體及其稀釋倍數(shù)分別為：COX-2(1∶1000)、β-action(1∶1000)、IκBα(1∶1000)、p-IκBα(1∶1000)、p65(1∶1000)、p-p65(1∶1000)。實驗所需抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。采用Image J軟件對蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.4 COX-2活性分析

采用COX活性檢測試劑盒(Cayman，美國)，通過熒光法對各實驗組細(xì)胞中的COX-2活性進(jìn)行檢測。

1.5 ROS含量測定

分別將各組細(xì)胞接種在96孔板上，對其進(jìn)行不同組別的預(yù)處理，然后用二氫乙錠孵育細(xì)胞，收集細(xì)胞并檢測熒光，評估細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.6 實時定量PCR(qPCR)分析

提取并收集各組細(xì)胞中的mRNA，取等量不同組別的mRNA進(jìn)行qPCR，反應(yīng)條件如下：95℃變性30 s，95℃擴(kuò)增6 s，重復(fù)40個循環(huán)，60℃30 s。選取同一樣本中的β-actin作為內(nèi)參，對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。引物序列詳見文獻(xiàn)[7]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

本研究采用SPSS21.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，使用GraphPad Prism 5.0軟件做圖，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05時，差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NFκB的激活介導(dǎo)H/R過程中COX-2表達(dá)上調(diào)

H/R能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生損傷，實驗組細(xì)胞在受到H/R刺激后，COX-2表達(dá)水平上升，LDH釋放量明顯高于對照組細(xì)胞；而加入NFκB抑制劑Helenalin處理后，COX-2水平下降，心肌細(xì)胞的LDH釋放量下降(圖1)。

圖1 H/R誘導(dǎo)后，各組細(xì)胞LDH釋放水平差異

在H9C2細(xì)胞受到H/R刺激后，伴隨COX-2升高的同時，IκBα降解增強，IκBα水平下降，IκBα和p65的磷酸化增強；Helenalin能夠有效抑制上述變化(圖2)。

2.2 抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導(dǎo)的促炎癥因子轉(zhuǎn)錄

與對照組相比，H/R刺激選擇性地誘導(dǎo)白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNFα)的mRNA表達(dá)，而不影響白介素-1β(IL-1β)；給予COX-2選擇性抑制劑NS398可顯著抑制IL-6和TNFα的高表達(dá)(圖3)。

2.3 抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS活性

在細(xì)胞受到H/R刺激后，與對照組相比，H/R組中ROS活性明顯升高；然而，這種H/R誘導(dǎo)的ROS活性增加能夠被COX2選擇性抑制劑NS398顯著抑制(圖4)。

3 討論

一直以來，COX-2被認(rèn)為與炎癥反應(yīng)息息相關(guān)，包括血管舒張、組織水腫和疼痛[8]，有研究顯示，COX-2的效應(yīng)蛋白前列腺素在MI/RI炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[9]。前期研究顯示，抑制COX-2將通過Akt/iNOS/NO信號通路保護(hù)心肌細(xì)胞免受凋亡的影響[6]。

研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在受到H/R刺激時，伴隨COX-2升高的同時，IκBα降解增加，IκBα和p65的磷酸化增強，以上結(jié)果均提示NFκB蛋白被激活[10]。為了檢測在H/R過程中心肌細(xì)胞中COX-2的誘導(dǎo)是否由NFκB介導(dǎo)，我們采用NFκB選擇性抑制劑Helenalin對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。抑制劑預(yù)處理顯著抑制了H/R所導(dǎo)致的COX-2誘導(dǎo)，提示H/R過程中COX-2表達(dá)上調(diào)由激活的NFκB介導(dǎo)。

圖2 受到H/R刺激后，各組細(xì)胞中不同蛋白的表達(dá)水平變化及量化分析

圖3 H/R后，各組細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNFα的mRNA表達(dá)水平及量化分析

圖4 H/R后，各組細(xì)胞中ROS活性量化分析

缺氧能夠誘發(fā)心肌細(xì)胞發(fā)生無菌性炎癥，大量炎癥因子釋放，細(xì)胞趨化、浸潤對心肌細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡以及隨后的心功能障礙[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，H/R刺激選擇性地誘導(dǎo)心肌細(xì)胞IL-6和TNFα的mRNA表達(dá)，二者是已知與促凋亡作用相關(guān)的炎癥因子[12,13]。TNFα是經(jīng)典NFκB信號通路的重要激活因子[14]，當(dāng)其轉(zhuǎn)錄活性增強時，能夠激活NFκB表達(dá)，并進(jìn)一步介導(dǎo)COX-2表達(dá)，造成心肌細(xì)胞損傷。COX-2選擇性抑制劑NS398能夠顯著抑制H/R介導(dǎo)的IL-6和TNFα轉(zhuǎn)錄水平變化，提示抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導(dǎo)的促炎癥因子轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。然而，對COX-2活性進(jìn)行選擇性抑制后，IL-6和TNFα的mRNA水平下調(diào)的分子機制尚不清楚，值得進(jìn)一步研究和探討。

MI/RI的發(fā)病機制十分復(fù)雜，涉及眾多病理生理因素的相互關(guān)聯(lián)，ROS聚集被認(rèn)為是導(dǎo)致MI/RI的重要原因之一[15]。在生理狀態(tài)下，體內(nèi)的ROS通過多種細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的代謝活動產(chǎn)生，ROS水平處于動態(tài)平衡狀態(tài)[16]。而在心肌缺血狀態(tài)下，COX-2被活化，在其催化前列腺素合成的過程中有大量ROS產(chǎn)生[17]，并促進(jìn)了心肌損傷進(jìn)一步加劇[15]。此外，過量的ROS產(chǎn)生還能夠打破NOS與NO之間的動態(tài)平衡，并影響NO的生物利用度[18]。有研究顯示，在MI/RI過程中，減少心肌細(xì)胞中ROS的形成，能夠在心臟組織中產(chǎn)生更高的NO含量，并縮小梗死面積[19,20]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞受到H/R刺激后，ROS活性明顯上升，而這一現(xiàn)象能夠被COX-2選擇性抑制劑NS398顯著抑制。這些證據(jù)表明，抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS活性，減輕細(xì)胞損傷。

目前，COX-2選擇性抑制劑廣泛應(yīng)用于缺血性心臟病的治療，進(jìn)一步了解COX-2如何影響心肌細(xì)胞凋亡可能具有深遠(yuǎn)的臨床意義。本研究的結(jié)果證實，在心肌細(xì)胞受到缺氧刺激時，NFκB的激活誘導(dǎo)COX-2表達(dá)上調(diào)，抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導(dǎo)的促炎癥因子轉(zhuǎn)錄以及ROS活性增強，從而發(fā)揮對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。