長鏈非編碼RNA 腦胞質RNA1在前列腺癌中的表達及作用機制

劉 明，陶思行，譚九峰，陳曉亮，晉學飛，王傳芳，那萬里

(1.四平市中心人民醫院，吉林 四平136000；2.吉林大學中日聯誼醫院；3.榆樹市中醫院)

前列腺癌是男性常見惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升趨勢。前列腺癌早期癥狀不明顯，大多數患者在初診時已為中晚期，預后較差[1]。因此，提高前列腺癌的臨床診療水平是十分必要的。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一組轉錄本長度超過200nt、且不編碼蛋白的RNA，其可在轉錄水平及轉錄后水平調控下游靶基因表達，并作為促癌基因或抑癌基因參與惡性腫瘤的發生與發展[2,3]。腦胞質RNA1(BCYRN1)是由人類染色體2p16編碼的一類lncRNA[4]。研究證實，BCYRN1在非小細胞肺癌[5]、宮頸癌[6]等惡性腫瘤中表達失調，且其表達異常與腫瘤進展密切相關。但BCYRN1與前列腺癌的關系尚未明確。本研究旨在觀察BCYRN1在前列腺癌中的表達及其與臨床病理特征的相關性，并通過干預BCYRN1表達研究其對前列腺癌細胞凋亡的影響，以期為前列腺癌的臨床診療提供依據。

1 材料與方法

1.1 組織標本采集選取2018年1月至2018年12月我院行手術切除的47例前列腺癌患者癌組織樣本和癌旁組織樣本(距離腫瘤組織邊緣>5 cm)，患者術前均未接受放化療治療。本研究經醫院倫理學委員會審批通過，患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞系和主要試劑人前列腺正常肌成纖維基質細胞WPMY-1、前列腺癌細胞株PC-3、22RV1、DU-145、LNcap購于美國ATCC；DMEM培養基、PBS緩沖液、胰蛋白酶、胎牛血清購于Hyclone公司；RT-PCR試劑、Bax單抗、Bcl-2單抗、Akt單抗購于大連Takara公司；Western blot試劑盒購于南京建成生物有限公司；LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑購于Invitrogen公司；CCK8試劑盒購于碧云天試劑有限公司。

1.3 細胞培養與轉染常規復蘇細胞，用含有10%胎牛血清+1%雙抗的DMEM培養液重懸浮細胞，并置于37℃、5% CO2培養箱中培養，每天換液1次。收集對數生長期的細胞，接種于細胞培養板中，細胞濃度為2×106cells/孔，采用LipofectamineTM2000用siRNA-NC、siRNA-BCYRN1對細胞進行轉染，細胞置于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h。

1.4 qRT-PCR檢測BCYRN1表達參照Trizol試劑盒說明書提取組織/細胞中總RNA，利用反轉錄試劑盒逆轉錄總RNA至cDNA，以此cDNA為模板并根據SYBR Premix ExTaqTM說明書行qRT-PCR，用公式2-△△CT計算BCYRN1的相對表達。BCYRN1引物序列：上游5’-CTGGGCAATA-TAGCGAGAC-3’，下游5’-TGCTTTGAGGGAA-GTTACG-3’；GAPDH引物序列：上游5’-CGCTC-TCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。

1.5 BCYRN1表達與前列腺癌患者臨床病理的關系根據BCYRN1的相對表達，將前列腺癌患者分為高表達組和低表達組，并分析BCYRN1表達與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、病理分級、T分期及Gleason評分的關系。

1.6 CCK-8檢測細胞增殖收集轉染后細胞，并接種于96孔板中，細胞終濃度為2×106cells/孔，分別于培養24 h、48 h、72 h、96 h時，棄去細胞培養液，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，孵育10 min，用全自動酶標儀測定波長OD450 nm處光密度值。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡收集轉染后細胞，將細胞置于37℃、5% CO2條件中繼續培養48 h，采用凋亡試劑盒(Annexin-V/PI)進行避光染色，1 h后上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。細胞凋亡率=[(右上象限細胞+右下象限細胞)/總細胞數]×100%。

1.8 Western blot法檢測凋亡相關蛋白表達收集轉染后細胞，蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測樣品蛋白濃度，取200 μl樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，4℃封閉4 h，后依次加入1∶2000濃度的Bcl-2、Bax、Akt、p-Akt 一抗(兔抗人Bcl-2和兔抗人Bax)、1∶500濃度HRP標記的二抗，按ECL試劑盒說明書行電化學發光檢測。

1.9 統計學方法采用SPSS20.0分析數據，計量資料用均值±標準差(Mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差檢驗，兩兩間比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 BCYRN1在前列腺癌組織及細胞中的表達分析

BCYRN1在前列腺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)(見圖1A)；與WPMY-1細胞比較，BCYRN1在PC-3、22RV1、DU-145、LNcap細胞中的表達明顯增高(P<0.05)，其中以PC-3、22RV1細胞最高(見圖1B)。

2.2 BCYRN1表達與前列腺癌患者臨床病理的關系

BCYRN1高表達與前列腺癌患者病理分級、T分期及Gleason評分有關(P<0.05)，與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移無關(P>0.05)(見表1)。

表1 BCYRN1表達與前列腺癌患者臨床病理的關系

2.3 轉染siRNA-BCYRN1對前列腺癌細胞中BCYRN1表達的影響

選取BCYRN1表達水平最高的兩株前列腺癌細胞PC-3、22RV1為對象，并分別轉染siRNA-NC和siRNA-BCYRN1，采用qRT-PCR檢測細胞中BCYRN1表達。與轉染siRNA-NC相比較，轉染siRNA-BCYRN1后細胞中BCYRN1表達顯著降低(P<0.05)(見圖2)。

圖1A 前列腺癌組織及癌旁組織中BCYRN1表達水平比較 圖1B WPMY-1及前列腺癌細胞中BCYRN1表達水平比較 圖2 轉染siRNA-BCYRN1對前列腺癌細胞中BCYRN1表達的影響

2.4 轉染siRNA-BCYRN1對前列腺癌細胞增殖的影響

CCK8結果顯示：與轉染siRNA-NC相比較，轉染siRNA-BCYRN1后PC-3、22RV1細胞增殖活性均顯著降低(P<0.05)(見圖3A、3B)。

2.5 轉染siRNA-BCYRN1對前列腺癌細胞凋亡的影響

流式結果顯示：與轉染siRNA-NC相比較，轉染siRNA-BCYRN1后PC-3、22RV1細胞凋亡率均顯著增高(P<0.05)(見圖4)。

2.6 轉染siRNA-BCYRN1對凋亡相關蛋白的影響

Western blot結果顯示：與轉染siRNA-NC相比較，轉染siRNA-BCYRN1后PC-3、22RV1細胞Bcl-2、p-Akt表達顯著減少(P<0.05)，Bax表達顯著增高(P<0.05)，而Akt表達無明顯變化(P>0.05)(見圖5)。

圖4 轉染siRNA-BCYRN1對PC-3、22RV1細胞凋亡的影響

3 討論

BCYRN1在多種惡性腫瘤中存在異常表達。Ren等[7]研究指出，BCYRN1在胃癌組織及胃癌細胞中均呈現高表達，且其表達與胃癌患者腫瘤大小及TNM分期呈正相關；沉默BCYRN1表達可明顯抑制胃癌細胞體外增殖、遷移，并可誘導細胞G1/G0期阻滯，促進細胞凋亡。Booy等[8]研究表明，在乳腺癌細胞和肺癌細胞中均可見BCYRN1過表達，而BCYRN1表達下調可抑制癌細胞增殖，并誘導其凋亡。本研究中，我們通過觀察前列腺癌組織和細胞系中BCYRN1表達變化發現，BCYRN1在前列腺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，且前列腺癌細胞中BCYRN1表達均明顯高于前列腺正常肌成纖維基質細胞(P<0.05)。進一步通過分析BCYRN1表達與前列腺癌臨床病理特征的相關性發現，BCYRN1高表達與前列腺癌患者病理分級、T分期及Gleason評分有關(P<0.05)，但與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移無關(P>0.05)。上述結果表明，BCYRN1在包括前列腺癌在內的多種惡性腫瘤中呈高表達，其表達上調可能參與了腫瘤的發生發展。

圖5 轉染siRNA-BCYRN1對PC-3、22RV1細胞凋亡相關蛋白表達的影響

之后，我們利用siRNA技術在前列腺癌細胞中實現了BCYRN1表達沉默，并以此分析BCYRN1在前列腺癌中的作用。結果發現：與轉染siRNA-NC相比較，轉染siRNA- BCYRN1可使得前列腺癌細胞中BCYRN1表達明顯下調，同時顯著抑制細胞增殖活性(P<0.05)，表明BCYRN1高表達是促使前列腺癌細胞惡性增殖主要原因之一。類似現象，也已在肺癌[9]、乳腺癌[10]中得到證實。此外，轉染siRNA- BCYRN1前列腺癌細胞凋亡率明顯增高，與轉染siRNA-NC相比差異顯著(P<0.05)，這表明BCYRN1可能是作為促癌基因參與前列腺癌的致瘤過程，并可調控前列腺癌細胞凋亡。

Akt信號通路位于細胞凋亡網絡的上游，其過度激活是癌細胞得以存活的重要機制[11，12]。本研究中，我們檢測了BCYRN1沉默后前列腺癌細胞中Akt的磷酸化水平，結果顯示：轉染siRNA- BCYRN1能夠明顯抑制前列腺癌細胞的Akt磷酸化，提示BCYRN1的促癌作用可能與調控Akt信號通路有關。Bcl-2、Bax是凋亡網絡中的核心蛋白，其中Bcl-2具有抑制細胞凋亡作用，而Bax則可促進細胞凋亡[13，14]。當Bcl-2過度表達或Bax表達降低，則易形成Bcl-2/Bax異二聚體，從而抑制細胞凋亡；反之，當Bcl-2表達下調或Bax表達增高，則可形成Bax/Bax同二聚體，誘導細胞凋亡發生[12，15]。本研究結果顯示，轉染siRNA- BCYRN1后，隨著前列腺癌細胞中Akt磷酸化水平的降低，其Bcl-2表達也顯著減少(P<0.05)，而Bax表達則顯著增高(P<0.05)。這表明，BCYRN1對前列腺癌細胞凋亡的調控機制，可能與激活Akt信號通路，進而調控Bcl-2/Bax表達有關。

綜上所述，BCYRN1在前列腺癌組織和細胞中高表達，沉默BCYRN1可抑制前列腺癌細胞增殖，并促進細胞凋亡，其機制可能與調控Akt信號通路有關。