白藜蘆醇抑制血管緊張素Ⅱ誘導的大鼠心肌成纖維細胞分化的作用和機制

丁玉紅，姚陡奇，郭秀穎

(吉林大學第一醫院二部 皮膚科，吉林 長春130031)

白藜蘆醇(resveratrol,Res) 是一種廣泛存在的非黃酮類多酚化合物，主要是從葡萄、桑葚、虎杖等提取出來的，是許多中藥的主要成分[1]，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒以及調節細胞代謝等多種生物學功能，目前在人體健康領域和動物生產中具有廣泛的應用[2]。

心肌梗死、心臟瓣膜病、高血壓等是老年人的常見以及高發疾病，而心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是這類疾病影響心臟功能的常見病理性改變。目前認為MF是由細胞外基質代謝異常而過度沉積導致的[3,4]。大量研究證明，腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活占據MF的主導地位，其中血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)可誘導心肌纖維化的發生[5]。近年來發現TGF-β1/Smads信號通路也與MF密切相關[6]。TGF-β1是TGF-β家族中強致纖因子，它可以趨化并誘導心肌成纖維細胞分化成肌纖維細胞，合成細胞外基質(ECM)并與細胞因子或者炎性因子反應；也可以直接刺激膠原蛋白等因子的表達，促進ECM的合成并且抑制其降解，進而導致ECM過度沉積，促使心肌纖維化的發生發展[7]。

白藜蘆醇對心血管疾病有很多保護作用[8]，但目前尚未明確其抗MF的相關機制。因此，本實驗擬在離體培養的大鼠心肌成纖維細胞(RDFs)上，觀察Res 對AngⅡ 刺激RDFs增殖和分化的抑制作用，并探討Res改善纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

白藜蘆醇購自上海晶純生化科技股份有限公司。大鼠心肌成纖維細胞系(RDFs)購于美國模式培養物保藏所 (ATCC,美國)。胰酶、青霉素鏈霉素雙抗及DMSO購自美國invitrogen 公司。I型膠原蛋白(Collagen I)和Ⅲ型膠原蛋白(Collagen Ⅲ)測定試劑盒購自南京建成公司。血管緊張素Ⅱ購自美國Sigma公司?？贵wPCNA、GAPDH購自CST公司；抗體a-SMA、TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3和Smad7購自abcam公司。BCA 蛋白定量試劑盒購自北京碧橙藍科技有限公司。余為市售分析純產品。

1.2 儀器

二氧化碳細胞培養箱購自美國Thermo Scientific 公司； 超凈工作臺購自上海智成分析儀器制造有限公司；高速低溫離心機(湖南湘儀公司)；超純水儀購自美國Merck Millipore 公司；X線膠片(樂凱公司)；電子分析天平(德國賽多利斯公司)；PVDF轉移膜(GE Healthcare公司，0.42 μm)。

1.3 大鼠心肌成纖維細胞RDFs的培養

RDFs培養于成纖維細胞培養基(Fibroblast medium,FM)中，含 1 %成纖維細胞生長因子、10 %胎牛血清和 100 U/mL 青霉素和鏈霉素。培養箱溫度 37 °C，95 %空氣混合 5% CO2。每 48 小時更換一次培養基。

1.4 細胞實驗分組

培養RDFs融合度達到85%-90%，將細胞的培養基更換成不含成纖維細胞生長的培養基，然后將細胞分為三組：對照組、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)組和Res組。AngⅡ組:培養基中加入AngⅡ(終濃度為1 μmol/L)，孵育細胞至24 h；Res組：培養基中同時加入AngⅡ(終濃度為1 μmol/L)和白藜蘆醇(終濃度為25 μmol/L)，共同孵育細胞至24 h；對照組：加入同等體積的PBS，孵育細胞至24 h。

1.5 大鼠成纖維細胞RDFs培養基中膠原蛋白collagen I和 collagen Ⅲ含量測定

三組細胞培養24 h 后，收集培養基，按照說明書，分別用ELISA試劑盒檢測collagen I和 collagen Ⅲ含量。在酶標儀上設置450 nm波長測量各孔吸光度并計算最終濃度。

1.6 Western blot 法檢測蛋白表達

三組細胞培養24 h后，吸棄培養液，PBS 洗3 遍，加入200 μl 細胞裂解液RIPA(含蛋白酶抑制劑)，超聲破碎細胞，提取蛋白樣品。SDS-PAGE 電泳分離蛋白，用電轉移法將蛋白質轉移到PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1 h 后，分別加入一抗，PCNA(1∶2 000)、α-SMA (1∶2 000)、TGF-β1(1∶1 000)、TGF-βRⅡ(1∶1 000)、Smad3(1∶1000)、Smad7(1∶1000)和 GADPH(1∶4000)，4℃孵育過夜，TBST洗3次，加入相應的二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，ECL顯色，用凝膠圖像分析系統進行掃描分析。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 Res可抑制Ang Ⅱ誘導的大鼠成纖維細胞RDFs中PCNA的表達

PCNA作為細胞增殖狀態的指標。本研究觀察到，與對照組相比，Ang Ⅱ 可誘導RDFs中的PCNA蛋白水平明顯增加 (P<0.05)，提示Ang Ⅱ可誘導RDFs增殖；而給予Res可以明顯降低Ang Ⅱ誘導RDFs中PCNA蛋白水平的增加(P<0.05)，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導的RDFs增殖，如圖1所示。

圖1 Res對Ang Ⅱ誘導的大鼠成纖維細胞RDFs中PCNA的表達的影響

2.2 Res可抑制Ang Ⅱ誘導的RDFs中α-SMA含量增加

α-SMA是成纖維細胞活化為肌成纖維細胞的標志，本研究觀察到，與對照組相比，Ang Ⅱ 可誘導RDFs中的α-SMA蛋白水平明顯增加 (P<0.05)，提示Ang Ⅱ可誘導RDFs發生分化；而給予Res可以明顯降低Ang Ⅱ誘導RDFs中α-SMA蛋白水平的增加 (P<0.05)，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導的RDFs發生分化，見圖2。

2.3 Res可抑制Ang Ⅱ誘導的RDFs培養基中膠原蛋白collagen I和collagen Ⅲ含量增加

肌成纖維細胞可以分泌合成細胞外基質，細胞外基質以膠原蛋白collagen I和 collagen Ⅲ為主。本研究觀察到，與對照組相比，Ang Ⅱ 可誘導RDFs培養基中的collagen I和 collagen Ⅲ含量明顯增加 (P<0.05)；而Res可以明顯降低Ang Ⅱ誘導RDFs中collagen I和 collagen Ⅲ含量增加 (P<0.05)，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導的RDFs分泌膠原，見圖3。

圖2 Res對Ang Ⅱ誘導的大鼠成纖維細胞RDFs中α-SMA的表達的影響

圖3 Res對Ang Ⅱ誘導的大鼠成纖維細胞RDFs中膠原蛋白collagen I和 collagen Ⅲ含量的表達的影響

2.4 Res可抑制Ang Ⅱ誘導的RDFs中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3含量增加及Smad7含量降低

TGF-β1/Smads信號通路與MF 密切相關。本研究觀察到，與對照組相比，Ang Ⅱ 可誘導RDFs中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3含量增加，降低Smad7含量 (P<0.05)；而給予Res可以明顯抑制Ang Ⅱ誘導的RDFs中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3含量增加，抑制Smad7含量降低 (P<0.05)，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導的RDFs中TGF-β1/Smads信號通路的活化，從而抑制纖維化。見圖4。

圖4 Res對Ang Ⅱ誘導的RDFs中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3和Smad7含量的影響

3 討論

心肌纖維化導致的并發癥已成為心血管疾病死亡的主要原因。心肌纖維化的發生發展與心肌成纖維細胞增殖、分化和分泌膠原有著緊密的聯系[9,10]。白藜蘆醇對心血管疾病有很明顯的保護作用[8]，但目前尚未明確其抗MF的作用及相關機制。本實驗發現用Ang Ⅱ誘導體外培養的RDFs 24 h后,RDFs中PCNA和α-SMA蛋白水平增多， TGF-β1、膠原蛋白collagen I和collagen Ⅲ明顯增加，并且TGF-βRⅡ和Smad3蛋白水平增加，Smad7蛋白水平降低，提示Ang Ⅱ誘導體外培養的RDFs增殖和分化、促進RDFs分泌膠原和活化TGF-β1/Smads信號通路促進纖維化；而給予白藜蘆醇可明顯改善Ang Ⅱ誘導的上述指標變化，提示白藜蘆醇可以抑制Ang Ⅱ誘導的RDFs發生纖維化。

心肌的成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，后者具有平滑肌細胞和CFs雙重功能，能夠合成細胞外基質，以膠原蛋白collagen I和collagen Ⅲ為主，并與TNF-α、TGF-β1等細胞因子發生反應，加速心肌纖維化的進程，促進心肌纖維化的形成[11]。α-SMA 是肌成纖維細胞的標志物[12]。PCNA作為細胞增殖狀態的指標[13]。本研究發現 Res可以明顯降低Ang Ⅱ誘導RDFs中α-SMA和PCNA的蛋白水平增加，抑制膠原蛋白collagen I和collagen Ⅲ的含量，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導的RDFs增殖和分化，并且抑制纖維化。

TGF-β1是目前已知的最強的促纖維化因子之一。TGF-β1/Smads信號通路上調可以促進心肌成纖維細胞增殖，并促進其分化為心肌成纖維細胞，從而促進膠原的含量增多，導致細胞外基質的積聚，促進心肌發生纖維化。以往的研究已經證實了 TGF-β1 與成纖維細胞[14]或周細胞[15]膜上的TGFβRⅡ 結合，形成復合體，活化 Smad2/3，轉位到細胞核中，啟動膠原合成相關的基因，產生前體膠原蛋白和纖維合成相關蛋白，促進心肌間質的I型和Ⅲ型膠原蛋白的沉積[16]。Smads 蛋白可以分為受體調節 Smads 蛋白、共同介質型 Smads 蛋白和抑制性 Smads 蛋白。Smad2/3 是受體調節 Smads 蛋白，與受體結合后，可上調 TGF-β1 信號通路相關蛋白的表達；Smad7 是抑制性 Smads 蛋白，阻止受體調節 Smads 蛋白磷酸化，從而阻斷 TGF-β1信號通路效應[17]。Smad7抑制TGFβ1信號通路的作用發揮在損傷后的早期階段，過表達Smad7可抑制TGFβ1介導的纖維化[18]。本研究結果顯示，Res可以明顯下調Ang Ⅱ誘導的TGF-β1含量增加、下調Ang Ⅱ誘導的TGF-βRⅡ和Smad3蛋白含量增加、改善Ang Ⅱ誘導的Smad7的蛋白含量的降低，提示Res通過抑制Ang Ⅱ激活的TGF-β1/Smads信號通路，從而發揮抑制纖維化的作用。

綜上所述，Res抑制Ang Ⅱ誘導心肌成纖維細胞增殖和分化及纖維化的作用機制可能與其抑制心肌成纖維細胞的增殖和分化，下調I型和Ⅲ型膠原蛋白含量、抑制TGF-β1/Smads信號通路活化從而抑制纖維化有關，為臨床解決纖維化等相關疾病的應用提供了一定的理論基礎。