表面增強拉曼散射技術無標記檢測乳腺癌細胞來源外泌體

熊紅蓮，王茗祎，謝慧嫻，顏倚媚，鐘會清

(1.佛山科學技術學院 a.物理與光電工程學院; b.口腔醫學院， 佛山528000；2.華南師范大學生物光子學研究院, 國家中醫藥管理局中醫藥與光子技術三級實驗室， 廣州 510631)

乳腺癌是危害女性生命的主要腫瘤之一，早期診斷和臨床治療可以顯著提高病人的生存率。現有乳腺癌的成像診斷技術包括鉬靶X射線和超聲影像，但只能檢測較小的腫塊[1]。傳統的血清腫瘤標志物糖類抗原(carbohydrate antigen 153，CA153)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)與乳腺癌抗原(breast cancer antigen 225，BCA225)等雖然可以檢測到早期的乳腺癌，但特異性和敏感性較低，容易造成誤診和漏診[2,3]。最近，液體活檢已成為一種極具潛力的方法，可早期診斷疾病和監測患者的健康。該方法基于使用各種技術檢測人流體循環中的腫瘤標志物，例如：循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)，循環腫瘤DNA(ctDNA)和外泌體的鑒定和定量。其中，由于外泌體在人體液中的穩定存在，分析患者體內循環的外泌體被認為是一種創新且有前途的方法，可用于癌癥的早期診斷。外泌體是活細胞分泌并排泄到胞外的微小囊泡，直徑為40～150 nm[4,5]。外泌體的成分反映了釋放細胞的組成成分，包括多種蛋白質、核酸等成分，以及特異性的 CD9、CD81、CD63、TSG101、HSP70、HSP90和miRNA 等生物分子[6]，可作為疾病診斷的新型標志物，是釋放細胞的“指紋”物。已有研究表明外泌體在乳腺癌細胞生長、增殖和轉移等過程中發揮重要作用[7]。有報道乳腺癌患者體液中外泌體的數量增多，其所攜帶的分子與正常乳腺上皮細胞釋放的外泌體顯著不同，尤其是核酸和蛋白質含量明顯增加[7]。

目前外泌體的檢測方法主要包括透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)，動態光散射(dynamic light scattering,DLS)，納米粒子跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)，流式細胞儀和蛋白質印跡[8,9]。其中，外泌體的TEM檢測是一項金標準，可以看到囊泡的形態和大小。但是SEM只能確定其存在，不能鑒別正常和腫瘤來源的外泌體。DLS和NTA也只能提供有關粒徑和分布的信息。流式細胞術既可以分析粒徑，還可以通過細胞熒光標記鑒定外泌體的來源和亞群。但是標準流式細胞術不能檢測到小于300 nm的顆粒。而蛋白質印跡需要破碎外泌體后，間接測定其表達的特征蛋白，如四跨膜蛋白(CD9，CD63和CD81)，熱休克蛋白等。因此腫瘤特異性的快速檢測仍然是一項具有挑戰性的任務。

拉曼光譜技術通過分子振動和轉動產生的光譜信號就可獲得分子的結構和物質的成分信息，樣品無需標記。因懸浮在PBS中的外泌體含量極小，拉曼散射效應十分微弱，難以獲得清晰的拉曼光譜。增加激光功率并延長曝光時間可以增強微弱的拉曼信號，但激光功率超過10 mW，易燒傷生物學標本[10]。表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)技術將大量的樣品吸附在粗糙的金屬表面，當激光束穿過懸浮膠體時，不僅可使拉曼信號增強1013～1014倍,還能夠抑制生物樣品熒光背景[11]。SERS技術具有靈敏度高、準確性好、操作簡單等優越性能，為外泌體檢測提供了新的希望。從理論上講，來自各種不同來源的外泌體具有特定功能的生物大分子。這意味著來自各種來源的外泌體具有特定的分子表型，從而反映不同的SERS譜型。因此SERS技術與外泌體檢測結合可區分不同細胞來源的外泌體。Park等[12]已經報道了應用SERS鑒別肺癌細胞來源的外泌體和正常細胞來源的外泌體的可行性。

本研究利用SERS技術檢測了從乳腺癌細胞MCF-7和人正常乳腺上皮細胞MCF-10A培養基上清中分離出來的外泌體，探索了SERS技術在乳腺癌中診斷的應用價值，比對了MCF-7和MCF-10A細胞來源的外泌體SERS光譜，同時篩選出兩種不同細胞來源外泌體的特征光譜，最后分析特征性光譜的形成原因。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺上皮細胞MCF-10A和人乳腺癌細胞系MCF-7均購于上海中國科學院細胞庫。表面增強的拉曼材料是納米銀增強基底，購于云洋光電(深圳)有限公司。圖1是納米基底的掃描電鏡圖，粗糙的表面可以增加納米材料的表面增強能力。

圖1 納米銀基底的掃描電鏡圖Fig.1 Scan electron microscope image of the silver film substrate

1.2 細胞培養

正常人乳腺上皮細胞MCF-10A采用DMEM/F12培養基(含10%HS、1%青霉素/鏈霉素、0.1%HCl、0.02%EGF、0.1%胰島素、0.01%霍亂毒素),在37 ℃和5% CO2的條件下進行培養，當細胞密度達到大約70%時，用PBS對細胞洗滌3次，加入無血清DMEM/F12培養基，繼續培養24 h，收集細胞培養上清液。

人乳腺癌細胞MCF-7在DMEM完全培養基中(含10%胎牛血清、青霉素100 μg/mL、鏈霉素100 μg/mL)，培養于37 ℃，5% CO2的細胞培養箱內。當細胞密度達到大約70%時，用PBS對細胞洗滌3次，加入含10%無外泌體的胎牛血清(Gibco)DMEM培養基，繼續培養24 h，然后收集細胞培養上清液。

1.3 培養基中外泌體的分離

本試驗采用差速超速離心法從細胞培養上清液中分離外泌體。收集細胞培養基上清液轉移至離心管中，于4 ℃下轉速為1 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清液轉移至新的離心管中，于4 ℃下轉速為2 000 r/min離心20 min，棄沉淀，上清液轉移至新的離心管中，在4 ℃下轉速為5 000 r/min離心30 min，棄沉淀，用0.22 μm微濾器過濾，留上清液，之后4 ℃下32 000 r/min超速離心90 min，低速離心獲得的細胞培養上清液不足時，用PBS緩沖液補充配平。去上清液，將離心獲得的沉淀用無菌PBS重懸。再次在4 ℃下32 000 r/min超速離心90 min，去上清液，用100 μL PBS重懸沉淀，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 外泌體的表征

透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM，日本電子株式會社JEM-1200EX)可視化測量外泌體大小；納米跟蹤儀(nanoparticle tracking analysis, NTA，Malvern，Nanosight LM 10)跟蹤外泌體，分析其大小和濃度。吸取樣本各10 μL滴加于銅網上，沉淀3 min，濾紙從邊緣處吸去浮液，PBS漂洗后磷鎢酸負染，常溫干燥5 min，電鏡成像。NTA儀器利用激光光源照射外泌體懸浮液，可觀察到帶有散射光的顆粒的布朗運動，并進行粒徑計算，同時得到整個體系的粒徑分布信息。用注射器吸取1 mL左右的樣品，然后向樣品池緩慢注入，設置參數，獲取粒徑分布結果。

1.5 SERS測量和數據處理

本試驗使用雷尼紹公司的顯微共聚焦拉曼光譜儀(Renishaw,inVia,UK)采集SERS數據。石英載玻片上置于激光共焦顯微拉曼光譜儀的顯微鏡載物臺上，納米銀基底置于石英載玻片上，然后將10 μL外泌體溶液滴于干燥的納米銀基底上，液滴消失后，基底表面為濕潤狀態，立即收集表面增強拉曼散射信號。拉曼信號采集的光譜范圍為800～1 800 cm-1，激發波長為785 nm，采集次數2次，曝光時間4 s，激發光功率約為0.5 mW，以防止功率過大燒傷樣品。所裝備的顯微鏡為萊卡DM2500，物鏡放大倍數50×。每個樣品在不同的位置獲得約30個SERS光譜。每次掃描前，均用硅片的520 cm-1峰進行校準。試驗重復3遍。為了減少不同光譜強度的差異和更好地對光譜形狀進行對比分析，所有的拉曼信號采集均在同一條件下進行。數據定量分析前，采用Vancouver拉曼譜處理軟件對所有譜線進行基線校正及熒光背景扣除。為了便于比較不同外泌體樣品光譜形狀和譜峰的相對強度，用強度法對光譜進行了歸一化處理。

2 結果與分析

2.1 MCF-10A來源外泌體和MCF-7來源外泌體外泌體的表征結果

采用透射電鏡TEM觀察外泌體的大小和形態；納米跟蹤儀(nanoparticle tracking analysis,NTA)檢測外泌體的粒徑和濃度。圖2a與圖2b分別為MCF-10A和MCF-7來源外泌體的TEM圖。在鏡下觀察，外泌體分布不均勻，體形態多變，測量大小在30～200 nm，脂質包膜膜結構完整，大多數都呈現出典型的杯狀結構，數個MCF-7來源外泌體有聚集的現象(圖2b)，這可能與TEM樣品制樣的沉淀過程有關。然后進一步利用NTA分析外泌體的大小和濃度，圖2c為MCF-10A外泌體粒徑圖，可以發現外泌體主要分布在50～150 nm之間，中位值在130 nm左右，外泌體濃度約為4.8×108particles/mL。MCF-7外泌體粒徑圖可以發現極少量外泌體分布在40～50 nm之間(圖2d)，主要分布在80～150 nm之間，中位值分布也在130 nm左右，外泌體濃度4.9×108particles/mL。但可以看到有少量的囊泡分布在200～400 nm之間，可能與外泌體的聚集有關。

圖2 外泌體的表征Fig.2 The characterization of exosomes(a)MCF-10A來源外泌體的透射電鏡圖(TEM)；(b)MCF-7來源外泌體的TEM圖；(c)MCF-10A來源外泌體的納米跟蹤儀(NTA)檢測結果圖；(d)MCF-7來源外泌體的NTA檢測結果圖(a)TEM image of MCF-10A-derived exosomes;(b)TEM image of MCF-7-derived exosomes; (c)NTA results of MCF-10A-derived exosomes;(d)NTA results of MCF-7-derived exosomes

2.2 吸附于納米銀表面的外泌體的SERS光譜

SERS技術檢測得到為正常乳腺細胞MCF-10A來源外泌體和乳腺癌細胞MCF-7來源外泌體SERS光譜(圖3)，主要差異反映在其核酸，蛋白質，脂類等譜峰的波數和相對強度的明顯變化，兩者的拉曼特征峰差異性顯著。MCF-10A外泌體和MCF-7外泌體SERS特征譜分別如圖3a和圖3b所示。由于外泌體包含相同的整體結構和大分子(脂質，蛋白質，核酸等)，因此在800～1 800 cm-1區域有共同的拉曼譜峰，858、938、999、1 032、1 318、1 602和1 655 cm-1，其分別歸屬于酪氨酸，脯氨酸和纈氨酸，苯丙氨酸，膠原或者脂類，核酸，酪氨酸和苯丙氨酸，蛋白的酰胺I帶[13]。MCF-10A來源外泌體和MCF-7來源外泌體的特征峰歸屬見表1。

表1 外泌體拉曼光譜譜峰歸屬Tab.1 Band position and assignment of exosomes from 800～1 800 cm-1

2.2.1 核酸分子的譜線的變化

1 031 cm-1譜帶源于核酸分子C- C鍵的拉伸振動，1 336 cm-1譜線歸屬于多核苷酸鏈。同時出現在MCF-7外泌體中的1 031 cm-1，1 336 cm-1處的拉曼峰，再一次證明MCF-7外泌體中的核酸顯著高于MCF-10外泌體。

2.2.2 蛋白質分子類譜線的變化

MCF-10A來源的外泌體中蛋白質的酰胺I帶特征譜帶位于1 655 cm-1處，而MCF-7來源的外泌體的譜峰頻移到1 642 cm-1處。該峰反映了蛋白質構象的α-螺旋和β-折疊結，無規則卷曲等特征。MCF-7來源外泌體在1 642 cm-1處的峰強雖無明顯變化，但位于938 cm-1的肽鏈骨架 C-C鍵振動峰卻明顯變弱。酰胺I帶和肽鏈骨架的特征拉曼峰與蛋白質的二級結構有關，是研究蛋白質二級結構的靈敏探針。肽鏈骨架峰強相對于酰胺I帶的減弱會導致蛋白質結構的無序性[25]。

在MCF-7外泌體的SERS光譜中還可以清楚地看到酪氨酸譜線由正常乳腺癌上皮細胞MCF-10A的853 cm-1處頻移到 857 cm-1，歸屬于色氨酸譜帶1 336 cm-1處的強度也有明顯的升高。這些譜線強度的增加表明癌變組織中氨基酸殘基含量增加，成為蛋白質拉曼光譜的主要貢獻者。值得注意的是，1 372 cm-1出現在MCF-10A來源外泌體峰譜中，該譜帶的存在說明色氨酸殘基的吲哚環呈埋藏式。而在MCF-7來源的外泌體中此特征峰消失，這說明氨基酸殘基所處的腫瘤微環境發生變化使色氨酸殘基的埋藏式吲哚環變為暴露式[26]。

2.2.3 脂類分子譜線的變化

正常乳腺上皮細胞外泌體中歸屬于脂類的特征譜線位于1 754、1 446和1 318 cm-1，而癌變組織中只觀察到1 318 cm-1處的峰藍移到1 315 cm-1，且峰發生了分裂。這些脂類分子可能主要來源于組織中的脂肪，這些譜線消失表明癌變組織中脂肪成分所占比例減少。另外，我們還觀察到在正常MCF-10A來源的外泌體中可見較強的1 372 cm-1(碳水化合物)，但是在MCF-7外泌體譜線卻觀察不到此峰。這可能是癌細胞的代謝比正常細胞活躍。

圖3 外泌體的表面增強拉曼散射(SERS)特征光譜Fig.3 The characteristic SERS spectrum of exosomes(a)MCF-10A來源外泌體SERS光譜;(b)MCF-7來源外泌體SERS光譜(a)SERS spectrum of MCF-10A-derived exosomes;(b)SERS spectrum of MCF-7-derived exosomes

3 討論

SERS技術是一種靈敏度度高、無標記、無損傷、簡單快速檢測物質成分的方法，能夠獲得清晰的良惡性細胞來源外泌體的拉曼特征光譜，從而協助診斷良惡性細胞腫瘤。普通的拉曼光譜技術也有極高的靈敏度，但血清和培養基上清中純化外泌體數量極少，獲得外泌體的特征譜不夠清晰，難以對疾病進行正確的評估。我們用SERS技術檢測了MCF-10A和MCF-7來源的外泌體，并繪制了800～1 800 cm-1頻移區段SERS光譜圖。通過分析比對方式尋找出了腫瘤細胞MCF-7來源外泌體的特征性拉曼光譜，然后對特征性光譜的可行性及其物質歸屬進行匹配。拉曼光譜是物質成分的表觀顯示，物質成分的變化使拉曼光譜波形數量和強度的改變以及波峰的頻移[27,28]。核酸、蛋白和脂類是構成外泌體表面的主要分子。這些物質成分在含量、結構、成分、表觀遺傳學發生任何變化，都可能會引起拉曼光譜的變化，導致SERS特征明顯不同。此前，Joseph等[29]已用SERS技術檢測了細胞與健康人血清和早期胰腺癌病人血清來源的外泌體，獲得了清晰的拉曼特征譜，成功的區分了不同來源的外泌體。在本研究中，也能觀察到SERS特征光譜明顯的改變。例如，歸屬為雙螺旋DNA骨架磷酸二酯的對稱伸縮振動的拉曼峰，在正常乳腺上皮細胞MCF-10A來源外泌體拉曼光譜的1 067 cm-1處，而乳腺腫瘤細胞MCF-7來源外泌體特征譜中紅移到1 072 cm-1處，且拉曼峰明顯變寬變高。核酸是關鍵的遺傳物質，核酸任何成分的增加或減少或結構構象的改變代表細胞新陳代謝和基因完整性發生變化。MCF-7中核酸的明顯增加表明了腫瘤細胞大量分裂繁殖。另外，相比MCF-10A外泌體，MCF-7中歸屬蛋白質肽鏈骨架938 cm-1處的拉曼峰變弱，表明了蛋白質結構的無序性。癌細胞旺盛的代謝消耗了大量的脂類，其分泌的外泌體的脂類拉曼峰也顯著變弱。良惡性細胞外泌體富含的蛋白質、核酸(DNA或RNA)及脂類的變化都會引起拉曼光譜的變化能夠協助鑒別良惡性腫瘤[30]。

本研究建立了一種基于外泌體和SERS技術的快速無損檢測方法，外泌體中的成分反映了釋放細胞的組成成分，通過分析比對SERS拉曼光譜，可用于區分正常和腫瘤來源的外泌體，進而協助診斷早期腫瘤。這項研究表明SERS技術可為癌癥的早期檢測和診斷提供了一種快速、無標記和無損的方法。

但該試驗和結果也有一定的局限性。首先我們僅僅選取乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞來源的外泌體做比較，想要得更客觀的結果，需要選擇多種乳腺癌細胞系與乳腺上皮細胞的外泌體拉曼光譜做對比，甚至選擇其他種類良惡性細胞外泌體拉曼光譜做對比，這樣篩選出的特征光譜更為可靠。其次，我們用的是細胞培養基分離出來的外泌體，但患者血清提純的外泌體更具有臨床實際應用價值。因此，下一步的試驗計劃是收集健康人和腫瘤患者的血液樣本，分離外泌體，然后用SERS技術進行檢測和鑒別。