口腔拭子DNA 在物證袋中轉(zhuǎn)移問(wèn)題的研究

王青松，劉泉

（1.湖北警官學(xué)院刑事技術(shù)與情報(bào)系2015級(jí)本科生，湖北 武漢；2.湖北警官學(xué)院刑事技術(shù)與情報(bào)系教師，湖北 武漢）

0 引言

口腔拭子中含有大量的DNA，目前已經(jīng)成為我國(guó)案件中的主要生物物證檢材。尤其在刑事案件中，口腔拭子會(huì)伴隨著杯子、煙蒂等遺留在形式犯罪現(xiàn)場(chǎng)，成為偵查人員突破案件的關(guān)鍵。在提取運(yùn)輸過(guò)程中，口腔拭子DNA 會(huì)在運(yùn)輸途中轉(zhuǎn)移到物證袋上。不同的物證袋來(lái)裝載樣本會(huì)讓DNA 的轉(zhuǎn)移量不同。隨著運(yùn)輸時(shí)間的不同，口腔拭子樣本與物證袋之間的DNA 的轉(zhuǎn)移量也不相同，即便是微量的DNA 轉(zhuǎn)移也有可能會(huì)造成STR 分型的不全或缺失，導(dǎo)致檢測(cè)難度加大。這類(lèi)生物物證檢材成為近年來(lái)法醫(yī)學(xué)DNA 分析領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。我國(guó)研究更多的是對(duì)于DNA 提取、定量、擴(kuò)增的過(guò)程進(jìn)行研究，通過(guò)對(duì)檢材本身進(jìn)行控制，來(lái)達(dá)到減少DNA 丟失的可能性。對(duì)于檢材保存和保存時(shí)間的變化的研究相對(duì)較少。當(dāng)現(xiàn)場(chǎng)條件有限，在現(xiàn)場(chǎng)取得的拭子樣本應(yīng)該放置在什么物證袋中能夠減少口腔拭子DNA 的轉(zhuǎn)移。在刑事案件偵破過(guò)程中，提取證據(jù)往往需要花費(fèi)大量的時(shí)間，不同保存時(shí)間口腔拭子DNA 遺失的速率也不一樣，所以本課題組在2019 年5 月制備制備口腔拭子9 個(gè)，分成6 h 組、24 h 組和48 h 組，研究口腔拭子在不同時(shí)間不同物證袋中DNA 的量如何變化，從保存生物檢材方面來(lái)降低口腔拭子DNA 的轉(zhuǎn)移率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

塑料物證袋（1 2 c m×1 5 c m）1 0 個(gè)，紙質(zhì)物證袋（1 2 c m×1 5 cm）10 個(gè)，用無(wú)菌棉簽刮擦口腔內(nèi)壁獲得的唾液DNA，夾子若干，標(biāo)簽紙，物證袋封口膜若干。

1.2 主要儀器與試劑

中德美聯(lián)AGCU-EX22 擴(kuò)增試劑盒，中德美聯(lián)AGCUEX22 測(cè)序試劑盒，9947A 試劑，蛋白酶K（Merck 公司，德國(guó)），DL-Dithiothreitol，Mastercycler pro Eppendorf?熱循環(huán)儀（Eppendorf 公司，德國(guó)），ABI 3500 遺傳分析儀。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制

在進(jìn)行每次實(shí)驗(yàn)前，對(duì)部分實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行擦洗或浸泡，所用試劑為0.05%的次氯酸和70%己醇，在對(duì)部分實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行干燥，干燥時(shí)需在無(wú)菌的無(wú)紡布上進(jìn)行，并用紫外燈照射至少24 h 以上。隨機(jī)選取5 個(gè)紙質(zhì)物證袋和5 個(gè)塑料物證袋以及5 根棉簽，然后對(duì)所選取的檢材進(jìn)行DNA 提取、定量、擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳，檢測(cè)結(jié)果均為陰性[1]。

1.3.2 不同時(shí)間段的口腔拭子DNA 樣本的制備

取3 根無(wú)菌棉簽同時(shí)在志愿者口腔內(nèi)壁上擦拭，將1 根放入紙質(zhì)物證袋，1 根放入塑料物證袋，6 h 后分別從2 個(gè)物證袋中拿出，用夾子懸空放置，另1 根用夾子夾住用來(lái)計(jì)算總體DNA 的量，用于對(duì)照，并用便簽紙分別對(duì)每根棉簽和物證袋進(jìn)行標(biāo)注。以此方法分別設(shè)立3 組，棉簽放入物證袋中的時(shí)間分別為6 h、24 h、48 h，分別放入干燥避光的地方。

1.3.3 檢材檢驗(yàn)過(guò)程

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，保持實(shí)驗(yàn)室溫度為（23±1）℃，空氣相對(duì)濕度保持為50%左右。使用Chelex-100 法對(duì)已經(jīng)進(jìn)行處理好的口腔拭子樣本進(jìn)行DNA 提取。將用來(lái)計(jì)算全部DNA量的棉簽用手術(shù)剪剪碎棉簽全部頭部，加到含適量純水的EP管中，用記號(hào)筆標(biāo)記為A，向沉渣懸液中Chelex-100～400 μL，同時(shí)加入80 μL 蛋白酶K（10 mg/mL）及20 μL DTT，輕輕混勻，以相同方法分別制備放入紙質(zhì)物證袋中的棉簽、紙質(zhì)物證袋將棉簽接觸部位、塑料物證袋將接觸棉簽部位、塑料物證袋中的棉簽并分別標(biāo)記為B、C、D、E。將5 份檢材用56 ℃孵育30 min，后高速振蕩20 s，再用100 ℃加熱8 min。取出，振蕩15 s，12000 rpm 離心3 min，在4 ℃條件下取上清液用于PCR 擴(kuò)增。其余幾組樣本用同樣方式進(jìn)行DNA 提取。24 h 樣本按照6 h 樣本制取方法依次標(biāo)記為A1、B1、C1、D1、E1。48 h 樣本按照6 h 樣本制取方法依次標(biāo)記為A2、B2、C2、D2、E2。

配置10 μL 體系擴(kuò)增試劑，在EP 管中加入MIX 試劑4 μL，再加入primer 2 μL，水2.6 μL，酶0.4 μL，以同體系配置9 份，將提取所得到的上清液樣品每份樣品及陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各取1 μL 加入到配置好的試劑管中。按照試劑盒程序進(jìn)行擴(kuò)增。待擴(kuò)增完畢，放入ABI 3500 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)3 組實(shí)驗(yàn)?zāi)０錝TR 分型圖譜所得出峰高來(lái)確定全部DNA 定量結(jié)果，將所測(cè)得的DNA 量以轉(zhuǎn)移率的形式進(jìn)行表述。注意觀察每一個(gè)圖譜的電子內(nèi)標(biāo)。通過(guò)將物證袋上提取到的口腔拭子DNA 的量和樣品上提取到的口腔拭子DNA 的量與物證袋上提取到的口腔拭子DNA 的量之和進(jìn)行對(duì)比來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)移率（轉(zhuǎn)移率=物證袋提取到的口腔拭子DNA量/物證袋提取到的口腔拭子DNA 量+樣品提取到的口腔拭子DNA 量）。將所得STR 分型圖譜與已知分型結(jié)果比對(duì)，當(dāng)?shù)任换蚍甯撸?0 RFU 者為有效分型結(jié)果。通過(guò)將檢測(cè)到的紙質(zhì)物證袋與塑料物證袋與袋內(nèi)棉簽DNA 總量與用來(lái)用作對(duì)照的棉簽DNA 總量進(jìn)行對(duì)比來(lái)計(jì)算檢測(cè)率（檢測(cè)率=物證袋和袋內(nèi)棉簽DNA 總量/對(duì)照用的棉簽DNA 總量）。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間不同物證袋DNA 峰值

本實(shí)驗(yàn)每個(gè)STR 分型圖譜均為單獨(dú)個(gè)體，樣品STR 分型圖譜峰值中有純合子峰值達(dá)到200 rfu 以上以及雜合子等位基因峰值均在200 rfu 以上的基因座標(biāo)記為成功檢出；當(dāng)樣品圖譜峰值低于200 rfu 的基因座標(biāo)記為未檢出。通過(guò)對(duì)D3S1368 等22 個(gè)STR 基 因 座 進(jìn) 行 分 析，6 h 樣 本A 中TH01 這對(duì)等位基因峰值達(dá)到32127，B 中TH01 峰值最高為17732，C 中TH01 峰 值 最 高 為2496，D 中D2S1338 等位基因中峰值最高為845，E 中TH01 等位基因峰值最高為11232。24 h 樣本中A1 中TH01 峰值最高為14476，B1 中TH01 峰值最高為7713，C1 中TH01 峰值最高為1404，D1中TH01 峰 值 最 高 為894，E1 中TH01 峰 值 最 高 為10560；48 h 樣本中A2 中D19S433 等位基因峰值最高為62910，B2中D19S433 峰值最高為41330，C2 中D19S433 峰值最高為8730，D2 中峰值最高的是TH01 為5030，E2 中D19S433 峰值最高為52360，詳細(xì)情況見(jiàn)表1。

表1 口腔拭子在紙質(zhì)物證袋和塑料物證袋中DNA 峰高值

2.2 不同時(shí)間各個(gè)樣本的轉(zhuǎn)移率

通過(guò)轉(zhuǎn)移率的公式計(jì)算可以得出，6 h 樣本中紙質(zhì)物證袋的轉(zhuǎn)移率為12.34%，塑料物證袋的轉(zhuǎn)移率為6.70%，塑料物證袋的轉(zhuǎn)移率比紙質(zhì)物證袋的轉(zhuǎn)移率低。24 h 的樣本中紙質(zhì)物證袋的轉(zhuǎn)移率為15.40%，塑料物證袋的轉(zhuǎn)移率為7.81%，48 h 的樣本中紙質(zhì)物證袋轉(zhuǎn)移率為17.44%，塑料物證袋的轉(zhuǎn)移率為8.76%。通過(guò)樣本檢測(cè)率的公式計(jì)算得出，6 h 樣本中紙質(zhì)物證袋的檢測(cè)率為37.04%，塑料物證袋的檢測(cè)率為62.41%；24 h 樣本中紙質(zhì)物證袋的檢出率為38.30%，塑料物證袋的檢測(cè)率為22.48%；48 h 樣本中紙質(zhì)物證袋的檢測(cè)率為20.43%，塑料物證袋的檢測(cè)率為8.77%，見(jiàn)圖1。

圖1 不同時(shí)間段唾液在紙質(zhì)物證袋和塑料物證袋轉(zhuǎn)移率

3 討論與分析

DNA 接觸轉(zhuǎn)移在法醫(yī)物證研究中占有重要地位，其中二次轉(zhuǎn)移更是近年來(lái)被法醫(yī)學(xué)者們?cè)絹?lái)越多的談?wù)揫2-3]。Mariya Goray 等人模擬常規(guī)刑事案件提取檢材對(duì)170 個(gè)手套上二次轉(zhuǎn)移的DNA 進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)有131 個(gè)手套上檢出高于閾值的等位基因，說(shuō)明二次轉(zhuǎn)移在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中非常常見(jiàn)[4]。浙江警察學(xué)院的學(xué)者通過(guò)對(duì)9 名志愿者在洗手后30 min、2 h、6 h 分別握持木柄螺絲刀、橡膠柄螺絲刀、膠木插頭1 min 和佩戴粗紗手套15 min，及手部脫落細(xì)胞的二次轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在洗手后30 min 和2 h 后，從手套中檢出11～16個(gè)基因座的人數(shù)為26 人，明顯多于從木柄檢出的14 人和橡膠柄螺絲刀中檢出的14 人，說(shuō)明不同類(lèi)型的客體DNA 的轉(zhuǎn)移率是不一樣的。本實(shí)驗(yàn)與以往研究不同的是，研究了同種物證在不同物證袋上DNA 的轉(zhuǎn)移情況以及隨著時(shí)間變化，不同時(shí)間段的檢材的轉(zhuǎn)移情況會(huì)有何不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有放在物證袋中的棉簽均發(fā)生了DNA 轉(zhuǎn)移，但不同的物證袋在相同時(shí)間內(nèi)，DNA 的轉(zhuǎn)移率不同，同一物證袋在不同時(shí)間下，DNA 的轉(zhuǎn)移率也不相同。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較它們的轉(zhuǎn)移率可知，放入紙質(zhì)物證袋中的口腔拭子DNA 轉(zhuǎn)移率三個(gè)時(shí)間段都要比塑料物證袋中的口腔拭子DNA 轉(zhuǎn)移率會(huì)高。原因可能是塑料物證袋是非滲透性材質(zhì)，而紙質(zhì)物證袋材質(zhì)是滲透性材質(zhì)。Gosch Annica[5]通過(guò)研究帶塑料柄的螺絲刀和帶涂層鋼制的撬棍也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)，帶塑料柄的螺絲刀STR 基因座DNA 轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn)率高達(dá)90%，帶涂層鋼制的撬棍STR 基因座DNA 轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn)率10%，滲透性客體的DNA 轉(zhuǎn)移率明顯高于非滲透性材質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示紙質(zhì)物證袋中的DNA 量隨著時(shí)間增長(zhǎng)在變多，紙質(zhì)物證袋中的DNA 的轉(zhuǎn)移率在3 個(gè)時(shí)間段里也逐步增大；塑料物證袋3 個(gè)時(shí)間段塑料物證袋的DNA 轉(zhuǎn)移率有輕微的上升，但總體上基本保持不變。這可能是塑料物證袋不透氣，不利于樣品的保存從而導(dǎo)致DNA 降解加速的原因。這說(shuō)明在犯罪現(xiàn)場(chǎng)如果遇到較為新鮮的生物物證，裝在塑料物證袋中比裝在紙質(zhì)物證袋中更容易減少DNA 的轉(zhuǎn)移。而在實(shí)際工作中，如果遇到微量DNA，為防止這些微量物證丟失，導(dǎo)致偵破案件難度加大[6]，建議選擇紙質(zhì)物證袋保存，這將有利于提高后期的檢出率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示同一時(shí)間段，同一組樣品中紙質(zhì)物證袋與紙質(zhì)物證袋中的棉簽中含有的DNA 總量和塑料物證袋與塑料物證袋中棉簽上含有的DNA 總量要比實(shí)際測(cè)得的用作對(duì)照的棉簽DNA 總量少（表1）。筆者分析，其原因可能有以下3 點(diǎn)：第一，這是因?yàn)樵谥苽銬NA 檢材過(guò)程中，用眼科手術(shù)剪剪取棉簽纖維時(shí)只剪取了棉簽表層，會(huì)有部分DNA 丟失。第二，同時(shí)物證袋樣本在制備過(guò)程中因?yàn)镋P 管較小，只剪取了棉簽頭放入的一部分，所以也有可能造成DNA 缺失。第三，也有可能在采用直接剪取法剪取物證袋時(shí)手套上或者是剪刀上也會(huì)沾染上DNA，導(dǎo)致實(shí)際物證袋和放入物證袋中棉簽的DNA 量加起來(lái)比對(duì)照組用來(lái)測(cè)量DNA 總量的棉簽含量低。這個(gè)現(xiàn)象提示我們?cè)谔崛NA 時(shí)要注意提取全面，同時(shí)法醫(yī)人員在運(yùn)送檢材時(shí)要注意檢材在物證袋中的移動(dòng)，避免DNA 轉(zhuǎn)移量增大。筆者在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)會(huì)有個(gè)別組的樣本STR 分型圖譜跑不出，當(dāng)同比稀釋之后，可以跑出正常的STR 分型圖譜。實(shí)際案件中一般只需要一小部分實(shí)驗(yàn)檢材能夠得出DNA 的分型圖譜，大量的DNA 容易導(dǎo)致峰值過(guò)高甚至DNA 測(cè)序儀測(cè)不出具體峰值。3 組時(shí)間段用來(lái)得出DNA 總量的棉簽DNA 量都不同，這與每次制備樣本時(shí)有關(guān)，樣本制備時(shí)用棉簽擦取口腔內(nèi)壁的力度次數(shù)都影響DNA 的含量。橫向分析可以看出，3 組實(shí)驗(yàn)效果都比較明顯，能檢驗(yàn)出大量的STR 基因座，說(shuō)明當(dāng)檢材新鮮時(shí)，檢材內(nèi)含有的DNA 量大，提取難度低、條件好時(shí)可采用Chelex-100法提取接觸DNA，能夠很好的發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，盡量避免檢查方法對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。

本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)48 h 塑料物證袋的檢測(cè)率異常低，其他樣品的檢測(cè)率屬于正常值。這種情況可能是因?yàn)樵谶M(jìn)行DNA 提取時(shí)沒(méi)有把物證袋上含有DNA 的范圍剪取全面造成DNA 遺失。3 個(gè)時(shí)間段的紙質(zhì)物證袋中的遺失率都比塑料物證袋的遺失率高，此種現(xiàn)象暫時(shí)無(wú)系統(tǒng)解釋?zhuān)写M(jìn)一步研究。

通過(guò)STR 分型圖譜可以看出6 h 樣本中存在有污染情況，存在污染的情況有很多種，可能有制備樣本時(shí)的污染，有可能是轉(zhuǎn)移過(guò)程中沒(méi)有做到絕對(duì)的防污染[7]，另一方面，實(shí)驗(yàn)室潛在的污染是對(duì)DNA 分型存在污染的進(jìn)一步的解釋?zhuān)词乖贒NA 提取過(guò)程中用了所有能夠避免污染的材料，我們?nèi)孕枰O(shè)定陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照來(lái)專(zhuān)門(mén)針對(duì)樣本管特異性污染。如今法醫(yī)界有不少學(xué)者對(duì)污染的各種不同類(lèi)型和檢測(cè)情況都進(jìn)行過(guò)討論，并對(duì)污染造成的潛在影響進(jìn)行評(píng)估，包括依據(jù)指南對(duì)STR 分析結(jié)果的解釋、最終獲得的數(shù)據(jù)等[8]。隨著科技發(fā)展，也許有一天能夠創(chuàng)立一個(gè)評(píng)估系統(tǒng)能夠?qū)ξ廴驹斐傻募訇?yáng)性結(jié)果進(jìn)行評(píng)估和能夠移除常規(guī)和LCN 模板證據(jù)處理中的危險(xiǎn)因素，以及創(chuàng)立對(duì)陰性對(duì)照進(jìn)行分析的應(yīng)用專(zhuān)家系統(tǒng)。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以得出以下結(jié)論：（1）口腔拭子DNA 在紙質(zhì)物證袋和塑料物證袋中都會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移；（2）同一時(shí)間下，塑料物證袋中口腔拭子DNA 的轉(zhuǎn)移率比紙質(zhì)物證袋中的轉(zhuǎn)移率低；（3）隨著時(shí)間推移，口腔拭子DNA 在紙質(zhì)物證袋中轉(zhuǎn)移量增大，而在塑料物證袋的轉(zhuǎn)移量基本不變。由此可以得出塑料物證袋比紙質(zhì)物證袋更適宜裝口腔拭子類(lèi)生物物證。