基于密碼子優化策略的牛妊娠相關糖蛋白9（bPAG9）的原核表達及純化

盧春霞 劉長彬 石國慶 楊華

摘要：為了構建pET30a-bPAG9重組表達載體，并在BL21（DE3） 感受態細胞中轉染高效表達牛妊娠相關糖蛋白9（bPAG9），通過生物信息學技術對bPAG9基因進行密碼子優化，人工合成bPAG9全基因序列，經雙酶切法將bPAG9基因插入到表達載體pET30a中。將構建的重組質粒pET30a-bPAG9轉染至BL21（DE3） 感受態細胞中進行原核表達，經過超聲波裂解和親和層析方法獲得重組蛋白bPAG9。用SDS-PAGE 和 Western Blot方法檢測重組蛋白bPAG9的表達效果。結果顯示，PCR擴增得到1 128 bp的優化bPAG9基因片段，構建的重組質粒pET30a-bPAG9經雙酶切獲得約5 244 bp和1 125 bp的2條片段，與預期值相符;對重組載體測序，測序結果與優化后的基因堿基序列完全一致，編碼的氨基酸序列未發生突變;SDS-PAGE 和 Western Blot 鑒定結果顯示，獲得相對分子質量約為4.0×104的bPAG9重組蛋白，通過親和層析純化后，重組蛋白bPAG9純度到達90%以上。

關鍵詞：牛妊娠相關糖蛋白;密碼子;重組蛋白;原核表達

中圖分類號：S823.9+13+.5文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）01-0122-08

Abstract：To construct the recombinant expression vector pET30a-bPAG9 and express bovine pregnancy associated glycorprotein-9（bPAG9） in BL21（DE3） cells， the codons of original bPAG9 gene were redesigned and optimized by bioinformatics techniques. Furthermore， the codon-optimized gene bPAG9 was synthesized by PCR and connected with pET30a vector by double digestion. The pET30a-bPAG9 expression vector was constructed and transfected into BL21（DE3） cells. The recombinant protein bPAG9 was obtained by ultrasonic lysis and affinity chromatography. SDS-PAGE and Western blotting were performed to detect the expression of the recombinant protein bPAG9. The results showed that the optimized bPAG9 gene fragment of 1 128 bp was obtained by PCR. After amplification and enzymatic digestion， two fragments of 5 244 bp and 1 125 bp were obtained from pET30a-bPAG9 expression vector. These results were consistent with expectations. The sequencing results of recombinant vector showed that the base sequence of bPAG9 gene in expression vector was consistent with the optimized gene， and the amino acid was not mutated. The results Westernblotting and SDS-PAGE indicated that the recombinant protein bPAG9 with the relative molecular weight of about 4.0×104 was successfully expressed in BL21（DE3） cells. The purity of recombinant protein bPAG9 was over 90% after purification by affinity chromatography.

Key words：bovine pregnancy associated glycoprotein;codon;recombinant protein;prokaryotic expression

妊娠相關糖蛋白 （ Pregnancy-associated glycoproteins，PAG） 是偶蹄類動物胎兒胎盤滋養層細胞合成、分泌的一類糖蛋白。1991年Zoli 等[1]從奶牛胎盤中分離得到相對分子質量為6.7×104的糖蛋白，與Butler等[2]發現的妊娠特異性蛋白 B （ PSPB ）有著高度的相似性，構成了一個龐大的胎盤糖蛋白家族，統稱PAG。PAG屬于天冬氨酸蛋白酶家族，與胃蛋白酶、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E有50%以上的相同氨基酸序列，但大多數PAG由于催化位點氨基酸發生置換使得其沒有酶活性。牛妊娠相關糖蛋白（bPAG）基因家族至少有 22 個轉錄本以及變異體，由胎盤滋養外胚層細胞和滋養外胚層的雙核細胞表達產生，有些在胚胎附植后進入母體血液 [3-5]，且整個孕期持續存在，常作為一種標志物用于家畜早期妊娠診斷[6-8]。

目前，基于免疫分析的商品化PAG檢測試劑盒在國外已大規模推廣應用，并取得較高的診斷準確率[9-10]。但國內關于PAG相關研究報道較少，無商品化的PAG蛋白和抗體銷售，而進口試劑盒檢測成本過高，限制了其在國內牧場的推廣應用。因此，如何獲取高純度PAG蛋白，研發相應的快速檢測方法及產品，是規模化養殖業急需解決的問題。

目前，已有研究者從多種哺乳動物胎盤子葉中分離出PAG 天然蛋白 [1， 11-12]，但是純化步驟繁瑣復雜，需要多種純化方法同時使用才能獲得高純度的PAG。也有人利用豌豆凝集素[13-14]及胃蛋白酶抑制劑[15-16]等特異性結合PAG，通過親和層析法分離獲得PAG，但該法成本較高，不利于PAG蛋白的大量純化。而體外重組蛋白技術為PAG結構、功能和應用研究提供了新思路，目前已有人在真核系統中表達了bPAG1[17]，但PAG1 在體內的半衰期較長，在母畜產后80～100 d內仍能檢測到，在此時間段內檢測易出現假陽性結果[6， 18]。有研究結果表明，bPAG9早在牛妊娠后25 d 就已經表達[3]，且在前3個月內轉錄水平顯著高于bPAG1 [19]。因此，bPAG9可作為理想的標志物用于家畜早期妊娠診斷。但迄今為止，尚未見到關于bPAG9重組蛋白的研究報道。

本研究根據bPAG9基因信息及宿主細胞對密碼子的偏好性，在不改變氨基酸序列的前提下對bPAG9基因密碼子進行優化，通過PCR方法擴增bPAG9全基因序列，然后構建proEM-bPAG9重組質粒，在BL21（DE3） 大腸桿菌中誘導表達bPAG9重組蛋白，為奶牛早期妊娠診斷產品的研發提供基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

BL21（DE3） 感受態細胞、pET30a載體、ECL化學發光試劑盒購自德泰生物科技（南京）有限公司，Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司，SDS-PAGR變性丙烯酰胺凝膠制備試劑盒、Ni-IDA 蛋白純化試劑盒、小鼠抗6× His單克隆抗體、蛋白質Mark、DNA mark、Nde I內切酶、Hind III 內切酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、二硫蘇糖醇（DTT）、苯甲基磺酰氟、谷胱甘肽、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸（EDTA）、咪唑（Imidazole ）、尿素（Urea ）等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。質粒抽提試劑盒、DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨、硫酸卡那霉素等購自Sigma公司。

1.2儀器與設備

VeritiTM 96梯度PCR儀，美國ABI公司產品;Gel Doc XR+凝膠成像系統，美國BIO-RAD公司產品;Essential V4凝膠成像系統，英國UVITEC公司產品;Powerpac 300電泳儀，美國BIO-RAD公司產品;DYCZ-24EN雙垂直電泳槽，北京六一儀器廠產品;DYCP-31BN瓊脂糖水平電泳，北京六一儀器廠產品;Thermo311 CO2 培養箱，美國熱電公司產品;Thermo ScientificTM Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數儀，美國賽默飛公司產品;AKTA Explorer 100 蛋白純化層析系統，美國GE公司產品;MicroPulser電轉儀，美國Bio-Rad公司產品;BSC -150 型恒溫恒濕培養箱，上海博訊事業有限公司產品;優普超純水制造系統，成都超純科技有限公司產品。

1.3方法

1.3.1bPAGP基因優化與合成根據 GenBank公布的bPAG9（登錄號：AF020511.1）基因序列，利用密碼子優化軟件MaxCodonTM[德泰生物科技（南京）有限公司]對bPAG9基因進行優化，在保證氨基酸序列不變的情況下，利用宿主細胞對密碼子的偏好性，將低頻密碼子替換為使用頻率高的密碼子，提高密碼子適用指數（CAI），同時降低序列中堿基重復結構，調整序列的G+C含量在理想區間（30%～70%）。并在優化基因5′端和3′端設計Nde I、Hind III酶切位點和His標簽序列。根據優化的bPAG9基因，應用 Primer premier軟件設計18條引物。引物1：5′-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGATCGTGAAAATCCCGCTGCGCCAAGTCAAAACCATGCGTAAAACCCTGTCCGGCAAAA -3′（下劃線為Nde I酶切位點）;引物18：5′-CTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCATTAATGATGATGATGATGATGAACCGCGCGTGCCAGACCAATA-3′（下劃線為Hind III酶切位點）（其余引物未列出）。然后通過全基因合成法擴增得到目的產物。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用 DNA 凝膠回收試劑盒回收目的片段。bPAG9基因優化及合成由德泰生物科技（南京）有限公司完成。

1.3.2pET30a-bPAG9重組載體的構建將pET30a載體用Nde I和Hind III進行雙酶切，pET30a載體酶切體系：pET30a載體5.0 μl、10×FD Buffer 5.0 μl、Nde I 2.5 μl （10 U/μl）、Hind III 2.5 μl （10 U/μl）、ddH2O 加至50.0 μl，37 ℃酶切1 h。酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒回收，將回收的酶切產物和目的DNA片段用連接酶在50 ℃連接25 min，連接體系：PAG9 DNA 4.0 μl、線性pET30a載體3.5 μl、T4 DNA連接酶 2.5 μl （5 U/μl）。

1.3.3pET30a-bPAG9重組載體的轉化、篩選與鑒定將連接產物使用42 ℃熱激法轉化到BL21（DE3）感受態細胞中，37 ℃培養1 h，取20 μl菌液涂到含有硫酸卡那霉素的LB 固體培養基平板上，37 ℃過夜培養。挑取單個菌落接種到新的LB培養基中，37 ℃、200 r/min震蕩培養4 h，取 2 μl菌液為模板進行PCR鑒定。上游引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′;下游引物：5′-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′。反應體系：菌液1.0 μl，上游引物 0.5 μl，下游引物0.5 μl，聚合酶0.5 μl，dNTP 0.5 μl （10 mmol/L），ddH2O加至50.0 μl;反應程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃變性25 s，62 ℃退火20 s， 72 ℃延伸40 s，25個循環;72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。將PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將初步判斷為陽性的轉化子接種到新鮮的LB培養基中，培養12 h后，收集菌液。采用質粒抽提試劑盒提取質粒，并對質粒進行雙酶切鑒定，酶切體系和條件：重組質粒5.0 μl、10×FD Buffer 5.0 μl、Nde I 2.5 μl （10 U/μl）、Hind III 2.5 μl （10 U/μl），ddH2O加至50.0 μl，37 ℃酶切1 h，將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR鑒定與雙酶切鑒定得到的陽性克隆送德泰生物科技（南京）有限公司測序。經測序驗證插入序列正確無誤后，進行質粒大量抽提，-20 ℃保存備用。

1.3.4表達菌株的制備將重組質粒采用42 ℃熱激法轉化到大腸桿菌BL21（DE3）表達菌株中，加入200 μl LB液體培養基，37 ℃、195 r/min培養1 h，取80 μl菌懸液涂布于含有50 μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板中，37 ℃培養過夜。次日挑取單菌落接種到含有50 μg/ml硫酸卡那霉素的LB培養基中，37 ℃振蕩培養3 h，取0.9 ml的菌液與0.1 ml 80%無菌甘油混合，-80 ℃保存。

1.3.5重組蛋白的誘導表達取表達菌株菌液20 μl接種到含有50 μg/ml的硫酸卡那霉素的LB培養基中，37 ℃、200 r/min培養過夜。次日接種到含50 μg/ml的硫酸卡那霉素的LB培養基中擴大培養，當OD600為0.5～0.8時，取少量樣品作為未誘導對照，其余菌液加入終濃度0.25 mmol/L IPTG，分別在15 ℃或37 ℃條件下誘導培養4 h。收集600 μl培養液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入50 μl PBS重懸沉淀，加熱變性，SDS-PAGE電泳分析。

1.3.6重組蛋白的純化收集擴大培養獲得的菌體，加入細胞裂解液Buffer A[50 mmol/L Tris （pH8.0）、300 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑、1 mmol/L DTT、1%TritionX-100、1 μg/ml Leupeptin]，超聲波裂解破碎菌體，4 ℃、12 500 r/min離心15 min，分別收集上清液和沉淀，上清液過0.45 μm濾膜。沉淀用Buffer B[50 mmol/L Tris （pH8.0）、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT、1% Triton X-100、2 mmol/L EDTA]重懸，超聲波裂解破碎，12 500 r/min、4 ℃離心15 min，保留沉淀，加入Buffer C[50 mmol/L Tris （pH8.0）、150 mmol/L NaCl、8 mol/L 尿素、20 mmol/L咪唑]，超聲波破碎，12 500 r/min、4 ℃離心15 min，上清液用0.45 μm濾膜過濾。采用Ni-IDA柱對以上兩種上清液分別進行親和層析，首先用Buffer A或Buffer C平衡Ni-IDA柱，直至吸光度A280接近基線，將制備好的上清液分別上柱，4 ℃孵育60 min，用15倍柱體積的Buffer A或Buffer C沖洗Ni-IDA柱，除去雜蛋白，直至吸光度A280接近基線，然后分別采用含50 mmol/L、100 mmol/L、500 mmol/L咪唑的Buffer A或Buffer C洗脫目的蛋白，流速1.5 ml/min。分別收集上清液、流穿液、洗脫液進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色檢測純化效果，收集含目的蛋白質的洗脫液。純化后的目的蛋白質采用BCA試劑盒測定濃度。

1.3.7重組蛋白的Western blot鑒定純化后的重組蛋白bPAG9經SDS-PAGE電泳后，取下凝膠，采用半干式電轉印法將重組蛋白bPAG9轉至PVDF膜上。PVDF 膜使用之前在甲醇中浸泡 30 s，之后將 PVDF 膜、凝膠、濾紙置于轉膜液浸泡，浸泡后將三者按照正確順序放在轉印儀上，轉印 45 min。取下 PVDF 膜于 5%脫脂奶粉中，室溫封閉2 h后，1×PBST漂洗3～4次，每次5 min。加入1∶2 000 稀釋的抗 His 標簽小鼠單克隆抗體，室溫孵育1 h，1×PBST漂洗。最后用ECL發光底物拍照。

2結果與分析

2.1bPAG9基因優化結果

GenBank公布（登錄號：AF020511.1）的bPAG9基因全長為1 311 bp，蛋白質編碼區（Coding sequence， CDS）長度為1 140 bp。對該基因進行優化后，優化基因bPAG9的密碼子適用指數（CAI）由0.73提高到0.89，G+C含量無明顯變化，優化前后分別為48.82%和49.00%，優化前后兩個基因的核苷酸同源性為63.4%，氨基酸序列完全一致。將優化的基因加入酶切位點、His標簽等序列，切去信號肽編碼序列，bPAG9優化基因序列全長1 128 bp，蛋白質編碼區序列為1 113 bp（圖1）。

2.2bPAG9優化基因 PCR擴增與鑒定

對bPAG9優化基因進行PCR擴增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果（圖2）表明，PCR成功擴增出帶有酶切位點的優化的目的基因bPAG9，片段大小約1 128 bp，與理論大小基本相符。

2.3重組質粒pET30a-bPAG9的構建及鑒定

將PCR擴增的優化的目的基因片段和線性化的pET30a載體進行連接，反應液轉化大腸桿菌 BL21（DE3）感受態細胞，構建牛妊娠相關糖蛋白9的重組表達載體pET30a-bPAG9。將鑒定為陽性克隆的重組質粒進行雙酶切，結果（圖3）顯示重組質粒電泳后呈現環狀、線性和超螺旋3種基本形態，酶切后的pET30a線性載體和bPAG9基因片段大小與理論值（5 244 bp和1 125 bp）相符，且酶切條帶單一，表明重組載體構建成功。將測序結果與優化后的bPAG9基因對比分析，堿基序列完全一致，符合率為100%，其編碼的氨基酸序列與GenBank （protein ID：AAC04682.1） 公布的完全一致，表明bPAG9優化基因插入片段完全正確，未發生任何堿基突變。

2.4bPAG9重組蛋白的誘導表達

測序正確的重組質粒pET30a-bPAG9轉入到BL21（DE3）大腸桿菌后，在相同的IPTG誘導濃度下，分別進行15 ℃和37 ℃誘導培養4 h，以未加入IPTG作為對照。SDS-PAGE檢測結果（圖4）顯示，15 ℃和37 ℃誘導條件下，在相對分子質量4.0×104左右均有明顯的蛋白質條帶，未誘導的對照則無相應的目的條帶。考慮低溫誘導表達有利于蛋白質的正確折疊，因此選擇誘導表達溫度為15 ℃。以上結果說明，bPAG9基因在原核表達宿主BL21（DE3）中成功誘導表達。

2.5bPAG9重組蛋白的純化

誘導表達后的菌株超聲波破碎后，對上清液進行Ni-IDA柱親和層析純化，隨后利用SDS-PAGE對純化的蛋白質進行檢測。結果（圖5）顯示，所有泳道均沒有目的蛋白，表明表達菌株裂解后上清液中沒有可溶性bPAG9重組蛋白。菌體破碎后收集的沉淀經2次超聲波溶解后，再經過Ni-IDA純化得到高濃度的融合蛋白，SDS-PAGE分析結果（圖6）顯示，菌體沉淀溶解后的上清液在相對分子質量約4.0×104處出現高濃度的目的條帶，表明bPAG9重組蛋白分布在沉淀即包涵體中，所有洗脫組分中均含有目的蛋白，其中含500 mmol/L咪唑的洗脫溶液獲得純度較高的bPAG9重組蛋白。經DS-PAGE分析，純化后的重組蛋白bPAG9純度大于90%。BCA方法測定其濃度為0.34 mg/ml。

Original為原始bPAG9基因序列，Optimized為優化后的bPAG9 基因序列，下劃線為優化后基因與原始基因的差異堿基位點，粗體為起始和終止密碼子，方框為Nde I和Hind III酶切位點，斜體為His標簽序列，省略號為刪除的信號肽位點。

2.6重組蛋白bPAG9的Western blot鑒定

純化的bPAG9重組蛋白C 端包含一個His 標簽，根據這一特性，利用 His標簽抗體對bPAG9重組蛋白進行Western blot檢測。結果（圖7）顯示，在相對分子質量約 4.0×104處有特異雜交條帶，與SDS-PAGE結果一致。bPAG9原始基因CDS長度為1 140 bp，包含9個外顯子和8個內含子，編碼379個氨基酸殘基（Amino acid， AA），信號肽區域位于第1～15位氨基酸殘基，蛋白質理論相對分子質量為 4.286×104，等電點8.82。優化的基因在去除信號肽和增加His標簽序列后，CDS長度為1 113 bp，編碼371個氨基酸，理論相對分子質量為 4.212×104。本研究原核表達的重組蛋白質相對分子質量約 4.0×104，與預期蛋白質大小基本一致，說明該重組蛋白質在原核表達系統中成功誘導表達。

3討論

牛妊娠相關糖蛋白 （bPAG） 種類繁多，人們利用RT-PCR技術從牛胎盤組織中篩選出了至少22種 PAG的cDNA轉錄本，根據其出現的時間將其分為古代組與現代組，古代組PAG出現在8.000×107年前，經過進化在約5.000×107年前出現現代組PAG[4]。 大多數bPAG如bPAG1、bPAG3、bPAG4、bPAG5、bPAG6、bPAG7、bPAG9、bPAG14、bPAG15、bPAG16、bPAG17、bPAG18、bPAG19、bPAG20、bPAG21、bPAG22屬于現代組，由胎盤滋養外胚層的雙核細胞表達產生，由于催化中心堿基發生了突變而不具有酶活性;而bPAG2、bPAG8、bPAG10、bPAG11、bPAG12、bPAG13屬于古代組，在整個滋養外胚層細胞中產生，保留了典型天冬氨酸肽酶的所有特征，具有酶活性[3，5，20]。由于bPAG家庭成員間的序列差異，bPAG基因在整個妊娠期的表達呈現時空特異性[3，5，19-21]，如Green等運用核糖核酸酶保護實驗檢測胎盤中RNA的表達，發現bPAG2、bPAG4、bPAG5、bPAG8、bPAG9、bPAG10、bPAG11 早在妊娠后25 d就已經表達，而bPAG1、bPAG6、bPAG7在妊娠后 45 d開始表達，主要存在于妊娠中后期[3]。而且，bPAG9在妊娠后3個月內表達水平顯著高于bPAG1 [19]。因此，bPAG9可作為一個更理想的標志物用于牛早期妊娠診斷。

由于bPAGs 蛋白種類繁多，增加了對其結構和功能研究的難度，體外重組蛋白質的出現為探究該類蛋白質的結構和功能提供了新思路。因此，前人對 bPAGs 在真核和原核系統中的表達進行了相關研究。Patel 等[17]構建真核表達載體PAG-pRcRSV，分別在HEK 293和CHO細胞中首次表達了PAG1重組蛋白，Western blot分析結果顯示，HEK293細胞表達效果優于CHO細胞。Telugu 等[22]為驗證古代組bPAG是否具有酶活性，利用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統成功表達了bPAG2 和 bPAG12重組蛋白，并對這2種蛋白質的水解活性進行研究，結果顯示2個重組蛋白質具有良好的蛋白質水解活性。但是真核表達系統操作復雜，且表達量低，成本較高。與真核表達系統相比，原核表達系統以其低成本、高表達等優點受到人們的青睞。國內對于PAG的研究極少，薄小輝[23]將bPAG4 基因插入到pET28a 原核表達載體后，轉化大腸桿菌 BL21，采用 IPTG 誘導表達bPAG4 重組蛋白，但蛋白質表達效率沒有報道。

本研究為提高bPAG9在BL21（DE3）的表達量，利用MaxCodonTM軟件在不改變氨基酸序列的前提下，通過消除稀有密碼子，利用偏好密碼子以及平衡G+C含量等策略對bPAG9基因進行優化，優化的bPAG9基因G+C含量為49%，密碼子適用指數（CAI）提高到0.89。然后通過全基因合成法合成了bPAG9優化基因，并將其成功插入到pET30a載體中，采用BL21（DE3） 感受態細胞經原核表達獲得表達量和純度均較高的bPAG9重組蛋白，為bPAG9抗體的制備和牛早期妊娠診斷產品的研發奠定了基礎。

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（責任編輯：張震林）